فحص الطيفي لمثبطات محتملة من الجلوتاثيون السيتوسولي S-Transferases
Summary
الجلوتاثيون S-transferases (GSTs) هي إزالة السموم الانزيمات المشاركة في عملية التمثيل الغذائي للعديد من الأدوية العلاجية. يرتبط فرط التعبير عن GSTs مع مقاومة العلاج الكيميائي للسرطان. طريقة واحدة لمواجهة هذا النمط الظاهري هو استخدام مثبطات. يصف هذا البروتوكول طريقة باستخدام مُسايسة قياس الطيفي لفحص مثبطات GST المحتملة.
Abstract
الجلوتاثيون S-transferases (GSTs) هي الإنزيمات الأيضية المسؤولة عن القضاء على المركبات الكهربائية الداخلية أو الخارجية عن طريق اقتران الجلوتاثيون (GSH). بالإضافة إلى ذلك ، GSTs هي المنظمين من kinases البروتين المنشط الميتوجين (MAPKs) المشاركة في مسارات موتوتوفية. ويرتبط فرط التعبير عن GSTs مع انخفاض الفعالية العلاجية بين المرضى الذين يخضعون للعلاج الكيميائي مع وكلاء الألكيليات الكهربائية. قد يكون استخدام مثبطات GST حلاً محتملاً لعكس هذا الاتجاه وزيادة فاعلية العلاج. تحقيق هذا الهدف يتطلب اكتشاف هذه المركبات، مع دقيقة، سريعة، وسهلة تحليل الانزيم. بروتوكول طيفي باستخدام 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) كما الركيزة هو الأسلوب الأكثر استخدام في الأدب. ومع ذلك، فإن التجارب المضادة للانزيم GST التي سبق وصفها لا توفر بروتوكولاً يفصل كل مرحلة من اختبار تثبيط الأمثل، مثل قياس ثابت Michaelis-Menten (Km)لـ CDNB أو الإشارة إلى تركيز الإنزيم المستخدم، المعلمات الحاسمة لتقييم قوة تثبيط مركب تم اختباره. وبالتالي ، مع هذا البروتوكول ، ونحن وصف كل خطوة من المقايسة الأمثل من التحليل الطيفي GST انزيم ، لفحص المكتبات من مثبطات محتملة. نحن نشرح حساب كل من تركيز مثبط نصف قصوى (IC50) وثابت تثبيط (Kط)-اثنين من الخصائص المستخدمة لقياس قوة مثبط انزيم. يمكن تطبيق الطريقة الموصوفة باستخدام مجموعة من GSTs المستخرجة من الخلايا أو GSTs البشرية النقية المؤتلفة ، وهي GST ألفا 1 (GSTA1) ، GST mu 1 (GSTM1) أو GST pi 1 (GSTP1). ومع ذلك، لا يمكن تطبيق هذا البروتوكول على 1 thta GST (GSTT1) ، كما هو غير ركيزة لهذا isoform. وقد استخدمت هذه الطريقة لاختبار قوة تثبيط الكركمين باستخدام GSTs من الكبد الخيول. الكركمين هو جزيء يعرض خصائص مضادة للسرطان وأظهر تقارب نحو isoforms GST بعد في توقعات الالتحام السيليكو. لقد أثبتنا أن الكركمين هو مثبط GST تنافسي قوي ، مع IC50 من 31.6 ± 3.6 μM و Ki من 23.2 ± 3.2 μM. الكركمين لديه القدرة على الجمع بينه وبين أدوية العلاج الكيميائي الكهروضي لتحسين فعاليتها.
Introduction
Cytosolic الجلوتاثيون S-transferase الإنزيمات (GSTs، EC 2.5.1.18) تحفيز اقتران الجلوتاثيون (GSH) في مختلف المركبات الكهربائية، مثل وكلاء العلاج الكيميائي، لإزالة السموم والقضاء عليها بسهولة من الجسم1. تم تحديد سبعة أشكال من cytosolic GST كما ألفا، مو، بي، سيغما، أوميغا، ثيتا، وزيتا. يتم التعبير عن GSTs بشكل رئيسي في الكبد والخصيات والرئتين والجهاز الهضمي2. وGST ألفا 1 (GSTA1) هو التعبير عن isoform للغاية في خلايا الكبد. الجسم غير متجانسة يعبر عن الأنواع الفرعية الأخرى، بما في ذلك GST pi 1 (GSTP1) في الغالب في الدماغ والقلب والرئتين، وGST مو 1 (GSTM1) في الكبد والخصيات3. على الرغم من وجود homology تسلسل عالية بين isoforms GST, كل المعارض خصوصيات الركيزة وتورط في استقلاب المخدرات والسرطان بطرق مختلفة, وفقا للتعبير التفاضلي4,5.
المركبات الكهربائية إما دخول الجسم خارجيا أو تنتج بشكل داخلي. المبيدات الحشرية والبروستاجلاندين والمواد المسرطنة والأدوية العلاجية الكيميائية هي بعض من الركائز المحتملة لردود فعل اقتران الجلوتاثيون6. على سبيل المثال، من المرجح أن يصبح أي مركب تفاعلي ناقص الإلكترونات يتشكل داخل الخلية الركيزة الكهربائية الزهرية. يتم التخلص من العوامل الألكيليات مثل الكلورامبوسيل أو الميلفالان كمقارنات من GSH حفزت من قبل GSTs، وقد تم ربط مستويات متزايدة من هذه الإنزيمات مع مقاومة لهذه المركبات6،7.
دور آخر مهم للGSTs السيتوسولي هو تنظيم نشاط kinases البروتين المنشط ميتوجين (MAPK) مثل MAPK8 (المعروف أيضا باسم c-Jun N-terminal kinase، أو JNK1) و MAP3K5 (المعروف أيضا باسم الكناسة المبرمج تنظيما للإشارة كيناز 1، أو ASK1)8. بعض isoforms في التشكل أحادية اللون الخاصة بهم ربط هذه البروتينات وبالتالي منع تتالي الفوسفور. في ظل الظروف العادية، فإن isoform GSTP1 عزل MAPK8 (المنشط للبروتين ج يونيو). الجمع بين ج يونيو مع بروتين C-Fos يشكل عامل النسخ البروتين المنشط 1 (AP-1)، وهو المسؤول عن تدوين الجينات الموالية لبروتينات. في الخلايا المجهدة ، والمجمع الذي شكلته GSTP1 و MAPK8 يتفكك ، يتم تنشيط ج يونيو ، والجينات المؤدية إلى المبرمج تبدأ في التعبير عن9. التعبير الأكبر عن هذا isoform GST قد يمنع المسار، مما يؤدي إلى زيادة جدوى الخلية، والمزيد من الانتشار الخلوي، وانخفاض حساسية الخلوية للعلاج الكيميائي. قد تحدث سيناريوهات مشابهة مع paralogs من GSTP1، على سبيل المثال، GSTM1، الذي يتفاعل مع MAP3K510.
الأدوار التي تقوم بها GSTs في استقلاب المخدرات وفي عزل MAPKs أدت إلى فرضية أن التعبير عن أكبر من GSTs قد يكون علامة على آلية مقاومة الورم للعلاج الكيميائي6,11. على سبيل المثال، GSTP1 هو overexed في العديد من أنواع السرطان وكان لها علاقة وجود مع سوء التكهن وزيادة حدوث الانتكاس8. وقد أظهرت تعدد الأشكال في هذه الجينات أيضا تفاضلية في معدلات التعرض للأدوية والبقاء على قيد الحياة للمرضى الذين يقدمون أمراضا مختلفة، مما يعزز فكرة أن هذه الإنزيمات حاسمة بالنسبة لآليات مقاومة الأدوية. على سبيل المثال، يرتبط الأفراد مع النمط الجيني GSTM1 خالية مع انخفاض إزالة المخدرات والبقاء على قيد الحياة أفضل12،13. هناك عدة وسائل محتملة لمواجهة هذا التعبير المفرط ، مثل استخدام نظائر GSH ، وprodrugs التي يتم تنشيطها عن طريق اقتران مع GSTs ، أو مثبطات GST المباشرة14،15.
كل هذه الأساليب هي حاليا قيد التحقيق، وبدأت بعض المركبات التجارب السريرية لاستخدامها المحتملة بين المرضى. ومع ذلك، على حد علمنا، لا توجد مركبات في استخدام مثبطات GST في إعدادات سريرية15. في الواقع ، فإن عدم وجود خصوصية لبعض isoforms أو استنفاد GSH في الخلايا العادية ، والتي قد تؤدي إلى سميات ناجمة عن تراكم أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في أنظمة الأعضاء ، ليست سوى بعض العيوب التي تقلل من إمكانات مثبطات GST14،15. خطر أن هذه المركبات قد تمارس تأثيرات أخرى الدوائية على الجسم هي أيضا الحد من استخدامها. حمض الإثاماريك، على سبيل المثال، هو مثبط GST الأكثر دراسة على نطاق واسع في البيئات المختبرية، ولكن لأنه يستخدم في المقام الأول كمدر للبول قوي، هذه الخاصية يحد من استخدامه في تركيبة مع أدوية أخرى في البيئات السريرية. الكركمين هو مركب طبيعي آخر تم فحصه بنجاح كمثبط GST. هذا الجزيء هو اثير البوليفينول المستخرج من أنواع Curcuma longa من الكركم. وقد أظهرت نتائج واعدة كخيار العلاج ممكن ضد السرطان عن طريق إحداث موت الخلايا المبرمج من نوع مختلف من خطوط الخلاياالسرطانية 16,17. يمكن للمجمع تنظيم مسارات خلوية متنوعة، مثل التيروزين كيناز18 أو مسار GST. وقد أظهرت الدراسات مع البروتينات النقية قوتها تثبيط على GSTA1، GSTM1 و GSTP119،20. ومع ذلك ، لوحظت نتائج متضاربة في الخلايا السرطانية ، حيث تم قياس نشاط GST أكبر داخل الخلايا عندما تم علاج الخلايا بالكرمين21. وهكذا، من المهم التحقيق في تركيز مثبط نصف أقصى (IC50) وثابت تثبيط (Ki)من أي مثبطات GST المفترضة باستخدام بروتوكول وصفها بوضوح مع الضوابط المناسبة قبل التخطيط لأي تجارب الخلوية أخرى.
ولذلك فإن فحص واختبار مثبطات ضريبة السلع والخدمات الجديدة المحتملة ذات أهمية سريرية كبيرة، ويجب أن يكون أي مركب جديد موجود آمنًا وفعالًا للاستخدام بالاقتران مع الأدوية الكهروفيلية. قد يؤدي تركيز الأبحاث على مثبطات isoform الخاصة إلى تمكين تثبيط GST في أنسجة الورم التي تعرض أنماطًا محددة من تعبير GST ، مما يسمح بتطوير علاج توليف فعال. وقد يكون العثور على مثبطات ذات أنماط تفاضلية من التثبيط موضع اهتمام أيضا. على سبيل المثال، يمكن أن يؤدي المانع التنافسي الذي يستخدم GSH كركيزة إلى استنفاده. وقد تبين هذا الانخفاض من تركيز GSH في الخلايا للحث على الإجهاد التأ المؤسد في الخلايا العصبية, مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج. ولا يمكن عكس طريقة أخرى شائعة من الكبح – تثبيط غير تنافسي – حتى لو كانت الركيزة موجودة بتركيزات عالية.
ويمثل معدل النشاط الأنزيمي من قبل ثابت مايكليس مينتين (Kم)والسرعة القصوى (Vماكس),والتي يمكن تحديدها عن طريق رسم رسم بياني ميخائيليس-مينتين, مع تركيز الركيزة ضد سرعة رد الفعل23. Km هو تركيز الركيزة المطلوبة لاحتلال نصف المواقع النشطة الأنزيمية، وهذا يعني أن Km عالية تمثل أقل تقارب. Vالحد الأقصى يمثل السرعة القصوى للتفاعل، التي تم التوصل إليها عندما تكون جميع المواقع النشطة مشغولة من قبل الركيزة. Km يساوي نصف Vكحد أقصى. 10- وهناك ثلاثة أساليب أكثر شيوعاً للكبح: التنافسية، وغير التنافسية، وغير التنافسية. في حالة تثبيط تنافسية، يرتبط المانع بالموقع النشط للأنزيم وينافس الركيزة. وبالتالي، لا يتغيرV max بعد إضافة المثبط، ولكن يزيد Km، حيث أن هناك حاجة إلى المزيد من الركيزة لمواجهة تثبيط. لا يحدث تثبيط غير تنافسي إلا عندما تشكل الركيزة مركبًا مع الإنزيم. في هذه الحالة، كما أن مستوى تثبيط يعتمد على الركيزة والانزيم التركيز، Vماكس وKم انخفاض عندما يضاف المانع إلى التفاعل. إن الطريقة الأخيرة من تثبيط غير تنافسية وهي مزيج من نمطين آخرين من التثبيط. يمكن أن يرتبط المانع بالموقع النشط للانزيم سواء كان الإنزيم مرتبطًا بركيزته أم لا. هنا Vالحد الأقصى النقصان بعد إضافة من المانع، ولكن Kم لا يغير24.
تم تطوير تحليل الطيفي الذي يقيس نشاط GST لأول مرة بواسطة Habig et al. في عام 1974 باستخدام 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) كركيزة لرد فعل22. الاقتران بين GSH و CDNB تشكل GS-DNB، الذي يعرض امتصاص الضوء الأقصى في الطول الموجي من 340 نانومتر، قابلة للتسجيل مع مقياس الطيف. معظم التقنية الموضحة أدناه مشتقة من Habig et al.، بما في ذلك معلومات عن أفضل الإعدادات ونقاط التحسين الهامة لمقايسة مثبطة. ويمكن تطبيق هذه التقنية على فحص مثبطات GST المحتملة ، سواء تم اختيارها من خلال اختيار الأدوية العقلانية باستخدام التنبؤات الحسابية أو عن طريق مراجعة الأدب. كما تناقش كيفية تكييف البروتوكول مع البروتينات GST توليفها حديثا أو isoforms محددة. على سبيل المثال، اختبار القوة المثبطة من isoforms GST التي تظهر متعددة الأشكال ذات الصلة سريريا أو من تعدد الأشكال أحادية النيوكليوتيدات (SNPs) يمكن أن تكون الاستخدامات المحتملة لهذا البروتوكول، واستهداف GSTs خاصة بالمريض.
يوفر هذا البروتوكول طريقة سريعة ومجدية وفعالة لفحص مثبطات GST المحتملة في المختبر قبل أي دراسات وظيفية أخرى. يتم وصف الخطوات اللازمة لتقييم الخصائص الأكثر قياساً للمثبط الأنزيمي: التركيز المثبط 50 (IC50) الذي هو تركيز المانع المطلوب لتقليل النشاط الأنزيمي إلى النصف؛ التركيز المثبط 50 (IC50) المطلوب لتقليل النشاط الأنزيمي إلى النصف؛ التركيز المثبط 50 (IC50) المطلوب لتقليل النشاط الأنزيمي إلى النصف؛ التركيز المثبط 50 (IC50) الذي يتطلب تقليل النشاط الأنزيمي إلى النصف؛ التركيز المثبط 50 (IC50) المطلوب لتقليل النشاط الأنزيمي بمقدار النصف؛ التركيز المثبط 50 (IC50) الذي يتطلب تقليل النشاط الأنزيمي بمقدار النصف؛ التركيز المثبط 50 (IC5 وثابت تثبيط (كط) الذي يمثل ثابت التوازن من تفكك بين المانع والانزيم، سمة من سمات تقارب بين هذين الجزيئين. يتم قياس هاتين القيمتين بالتراجع غير الخطي وباستخدام معادلات محددة لكل طريقة من أشكال التثبيط، على التوالي. كما نبرهن على تقييم هذا النمط من تثبيط، وذلك باستخدام المؤامرات Michaelis-Menten لتحديد تغييرالخامس ماكس وKم بعد إضافة المانع23،25،26.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن نقدم بروتوكول يصف كل خطوة من قياس قياس الطيفي GST انزيم المقايسة، لشاشة مثبطات مُحتَل(الشكل 1، الجدول 1)وتحديد فعاليتها المثبطة. وأكدنا أيضا على المعايير الأكثر أهمية للنظر في أنزيم دقيقة المقايسة توفير نتائج قابلة للتكرار. المزايا الرئيسية للبروتوكول الموصوف على الطرق الأخرى لقياس الألوان أو قياس الطيف الكتلي هي أن هذا البروتوكول سريع وسهل الأداء ويوفر قياسات كمية لنشاط GST بالإضافة إلى قوة تثبيط الجزيئات التي تم فحصها.
نقدم طريقة حساب اثنين من أهم معلمات Michaelis -Menten من مثبطات انزيم: IC50 وKi. وسوف مثبط قوي بذل أدنى ممكن KI وIC50, مشيرا إلى أن تقارب بين المانع والانزيم هو ارتفاع30. كما IC50 يعتمد على تركيز الانزيم وشروط الفحص33، قد يكون من الصعب استخدام هذه القيمة لمقارنة مثبطات من تجارب مختلفة أو الحصول عليها باستخدام شروط أخرى فحص34. استخدام ثابت من تثبيط Kأنا هو مؤشر أفضل من قوة المثبطة من المركبات المحتملة. Kط يمكن استخدامها لمقارنة اثنين من مثبطات مع وسائط مختلفة من تثبيط، كما أنه يعتمد فقط على تقارب بين المانع والانزيم. ومع ذلك، أن يكون فكرة واضحة عن طبيعة تثبيط واحد يجب تحديد كل من المعلمات المانع30. قمنا بقياس IC50 وK ك 31.6 ± 3.6 ميكرومتر و 23.2 ± 3.2 ميكرومتر على التوالي ، مما يشير إلى أن هذا المركب هو مثبط GST قوي.i وأكدت هذه النتائج في توقعات silico، التي تقدر قيم KI بين 27.4 إلى 78.1 μM لمختلف isoforms GST الإنسان والتكريم.
نشاط انزيمي أو معدل رد الفعل وكمية الإنزيم
كما ذكر أعلاه، يعتمد IC50 على تركيز الإنزيم، وإجراء تجربة مع مستوى غير معروف من النشاط الأنزيمي قد يؤدي إلى استنتاجات خاطئة33. للسيطرة على عوامل أخرى، والتي قد تقلل من النشاط المثبط، ينبغي للمرء أن يأخذ في الاعتبار ويقيس النشاط الأنزيمي لكل دفعة جديدة من GSTs. على سبيل المثال، قد يؤدي تدهور دفعة انزيمية، الناجمة عن دورات تجميد/ذوبان كثيرة جدا، إلى تقليل النشاط وبالتالي إلى انخفاض IC50 حتى لو كانت التجربة قد أجريت في ظل نفس الظروف. وبعبارة أخرى، فإن استخدام 0.01 وحدات من انزيم لا تعطي نفس النتائج باستخدام 1 وحدة. استخدام الإنزيمات كثيرة جدا قد يؤدي إلى استنفاد سريع للركيزة ورد الفعل لن يكون لها شكل خطي. وبالتالي يمكن أن يؤدي هذا المعلم إلى نتيجة غير دقيقة، حيث لن ينظر إلى أي تغيير في الامتصاص بعد فترة حضانة طويلة.
Kم القيمة
لضمان أفضل الظروف لتقييم نوع تثبيط التي تظهر من قبل المانع، يجب أن يكون تركيز الركيزة مساوية أو أقل من ثابت مايكليس مينتين (Kم). يتم تمثيل Km من قبل تركيز الركيزة المطلوبة لاحتلال نصف المواقع النشطة على انزيم28. فعلى سبيل المثال، يمكن أن يؤدي ارتفاع تركيز الركيزة إلى مواجهة المانع التنافسي، وسيكون من الصعب تقييم هذا النوع من التثبيط في مثل هذه الظروف. وهكذا، فإن إحدى الخطوات الحاسمة في هذه المنهجية هي تحديد الـ Km للانزيم للركيزة المختارة (هنا CDNB). في بعض الدراسات، لم يتم تحديد هذه القيمة وهذا يمكن أن يؤدي إلى استنتاجات خاطئة حول نمط تثبيط الناجمة عن المانع، وإذا كان وضع تثبيط غير صحيح، وسوف يتم حسابK ط بشكل غير صحيح كما تعتمد المعادلة على نمط تثبيط26،28. إذا تم اختبار isoform GST مختلفة، تقييم جديد لقيمةم ك إلزامي، لأن هذه القيمة هي فريدة من نوعها لزوج من الانزيم ويغاند. كما استخدمنا تركيز CDNB أقل قليلا من Kم (0.2 mM), التي حددناها بأنها 0.26 ± 0.08 mM, تم تحديد الوضع التنافسي المتوقع من تثبيط الكركمين على GST بدقة.
IC50
الحصول على منحنى السيني جيدة التي لتقدير IC50 يتطلب العثور على كل من الهضاب السفلية والعلوية. الهضبة السفلية تمثل تركيزات المانع التي توفر أقصى قدر من النشاط المثبط. في بعض الحالات، قد لا يمنع مركب الإنزيم بشكل كامل، حتى في تركيزات عالية، بسبب مشاكل تقنية مثل القابلية للذوبان. ومع ذلك ، يمكن أن تتناسب أدوات مثل GraphPad Prism مع الهضبة السفلية بدقة تامة. تتكون الهضبة العليا من تركيزات المثبطات ، والتي لا تكفي لمنع الإنزيم ، وبالتالي فإن النشاط أقصى. كل من هذه الهضاب حاسمة لتحديد IC50 وكذلك التركيزات بينهما، من أجل العثور على منحدر المنحنى – ثم يمكن أن تستمد IC50 من شكل منحنى السيني35. الكركمين هو غير قابل للذوبان في الماء، وبالتالي الحد الأقصى للتركيز المستخدمة في هذا الفحص محدودة، لتجنب هطول الأمطار في محلول المقايسة. وهكذا، استخدمت حلول أقل تركيزاً، لا تمنع تماماً نشاط ضريبة السلع والخدمات. وأثار ذلك مسائل لتحديد الهضبة السفلية. لمواجهة هذه المشكلة، توقعنا القيم السفلية استناداً إلى الرسم البياني الانحدار غير الخطي، الذي قدم IC50 من 31.6 ± 3.6 μM الكركمين (الشكل 3A). بالنسبة لحمض الإثاكريك، لم تكن هناك حاجة للتنبؤ بالقيم للهضبة السفلية لأن هذا المركب قابل للذوبان في محلول المقايسة وتم قياس IC50 عند 6.6 ± 1.1 ميكرومتر.
ويمكن تطبيق هذه الطريقة على isoforms GST الأكثر تعبيراً في الإنسان، وهي GSTA1، GSTM1 أو GSTP1. غير أن هذا البروتوكول غير مناسب لتحديد نشاط الشكل الأيزوي GSTT1، لأن المجلس ليس ركيزة لهذا النوع الفرعي. 36، 37 وفي الوقت نفسه، يمكن تعديل البروتوكول قليلاً لمواجهة هذه المشكلة. على سبيل المثال ، باستخدام 1،2-الايبوكسي-3-(4′-نيتروبينوكسي)(ENPP) كركيزة لGSTT1 وقياس كمية من الاقتران في 360nm بدلا من 340nm. 37
يمكن أن تكون خطوات البروتوكول تكييفها وتطبيقها لاختبار نشاط GST واختبار المانع في تجارب ثقافة الخلايا. قياس نشاط GST على الخلايا المعالجة مع وبدون مثبط GST سوف تشير إلى ما إذا كان يمكن استخدام هذا المركب في مثل هذه الإعداد التجريبية. ومن المثير للاهتمام خاصة عندما يكون مثبطات ليبوفيلي. على سبيل المثال، عرضنا أن الكركمين هو مثبط GST قوي باستخدام هذا البروتوكول. ومع ذلك، قد يكون تطبيقه على الدراسات الخلوية محدودا، لأن الجزيء غير قابل للذوبان في الماء بشكل ضعيف ويتحلل بسرعة في الوسط. (31) من الممكن تحسين هذا البروتوكول من خلال تحديد غير الشكل غير الركيزة CDNB. استخدام هذا البروتوكول في دراسات الخلية سوف تعطي فقط معلومات حول نشاط GST الشاملة، ولكن ليس على نشاط النوع الفرعي GST دقيقة. إضافة الركيزة isoform محددة و / أو باستخدام ISOFORM GST المؤتلف محددة تسمح لاختبار isoform مثبطات GST محددة.
في الختام، نحن وصف إجراء كامل لاختبار مثبطات GST التي يمكن استخدامها في تركيبة مع العلاج الكيميائي الكهربائي. وأكدنا على الخطوات الحاسمة من إنزيم GST واختبار تثبيط، لاختبار جزيء مثيرة للاهتمام المحتملة وتحديد كفاءتها كما المانع مع القيم الكمية، IC50 وKi. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي مركب مُفتَقَد، كما يمكن تنفيذها على الأشكال الأيزوفورمات GST البشرية الأكثر تعبيراً (GSTA1، GSTM1 و GSTP1)، أو تكييفها قليلاً لأداء دراسات ثقافة الخلية مع مثبطات GST أو قياس نشاط أيزوفورم GST آخر مثير للاهتمام من الاختيار.
| الكواشف | اسم | التركيز في محلول المقايسة | الاخري |
| الركيزه | CDNB | قياس Km (mM) | مخففة في 95٪ الإيثانول. يجب أن يكون تركيز الإيثانول النهائي ≤ 5٪ (v/v) |
| الركيزة المترافقة | GSH | 2.5 مليون متر | مخففة في الماء. |
| يجب أن تشبع تركيز الحل. | |||
| المخزن المؤقت | برنامج تلفزيوني | – | pH = 7.1 |
| انزيم | تجمع من isoforms GST أو isoform نقية | 0.01 وحدة/مل، تحدد تجريبيا. | مخففة في الماء. |
| مثبط GST | مركب محتمل من الاختيار | IC50: 3 تركيزات تمنع الحد الأقصى، 3 التي تمنع الحد الأدنى، و 3 في ما بين. | مخففة في DMSO ثم في الماء، أن يكون التركيز النهائي من DMSO ≤ 1٪ (v/v) |
| كط: 3 تركيزات حول IC50. | |||
| معلمات | |||
| درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) | |||
| pH = 7.1 | |||
| ≤ 1 في المائة (v/v) | |||
| الإيثانول ≤ 5% (v/v) | |||
الجدول 1: ملخص الكواشف والمعلمات التي يجب مراعاتها أثناء إجراء فحص لتثبيط ضريبة السلع والخدمات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت مؤسسة كانسيرس هذا العمل البحثي. ويود المؤلفان أن يعترفا بالسيدة لورانس ليس والسيد يوان سارمينتو للمساعدة التقنية، ولا سيما في إجراء تجارب التكرار مع توحيد الأقوال التي بها مثبطات. والمناقشات المثمرة والمدخلات التي أجراها السيد دينيس مارينو، والدكتورة سيمونا ملاكار، والدكتور فيد ملاكار، هي مناقشات ومداخلات، وهي مناقشات ومداخلات ونُقِر بها. نشكر الدكتورة باتريشيا هويزو دياز كورتيس على مساعدتها في سرد الفيديو. نشكر الدكتور Muthukumar على مدخلاته في توقعات silico. كما نشكر السيد دارين هارت على مساعدته في قراءة هذه المخطوطة باللغة الإنجليزية.
Materials
| 1-Chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) | Sigma-Aldrich | 237329 | Substrate used for the GST enzymatic assay |
| Corning UV-Transparent Microplates | Sigma-Aldrich | CLS3635 | Transparent plate to perform the enzymatic assay. When using 200 ul, the pathlength is 0.552 cm for this plate. |
| Curcumin | Sigma-Aldrich | 8511 | Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | To prepare the stock of the putative inhibitor |
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Buffer for the enzymatic reaction |
| Ethanol 95% | Fisher scientific | 10542382 | To dilute the CDNB |
| Glutathione S-Transferase from equine liver | Sigma-Aldrich | G6511 | Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin |
| L-glutathione reduced (GSH) | Sigma-Aldrich | G4251 | Co-substrate for the GST enzymatic assay |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | To quantify the amount of protein present in the enzymatic solution |
| Spectramax iD3 | Molecular devices | To do spectrophotometric measurments |
References
- Mannervik, B., Danielson, U. H. Glutathione transferases–structure and catalytic activity. CRC Critical Reviews in Biochemistry. 23 (3), 283-337 (1988).
- Awasthi, Y. C., Sharma, R., Singhal, S. S. Human glutathione S-transferases. The International Journal of Biochemistry. 26 (3), 295-308 (1994).
- Rowe, J. D., Nieves, E., Listowsky, I. Subunit diversity and tissue distribution of human glutathione S-transferases: interpretations based on electrospray ionization-MS and peptide sequence-specific antisera. Biochemical Journal. 325, 481-486 (1997).
- Beckett, G. J., Hayes, J. D. Glutathione S-transferases: biomedical applications. Advances in Clinical Chemistry. 30, 281-380 (1993).
- Oakley, A. Glutathione transferases: a structural perspective. Drug Metabolism Reviews. 43 (2), 138-151 (2011).
- Townsend, D. M., Tew, K. D. The role of glutathione-S-transferase in anti-cancer drug resistance. Oncogene. 22 (47), 7369-7375 (2003).
- Tew, K. D. Glutathione-associated Enzymes in Anticancer Drug Resistance. Cancer Research. 54 (16), 4313-4320 (1994).
- Laborde, E. Glutathione transferases as mediators of signaling pathways involved in cell proliferation and cell death. Cell Death and Differentiation. 17 (9), 1373-1380 (2010).
- Adler, V., et al. Regulation of JNK signaling by GSTp. The EMBO Journal. 18 (5), 1321-1334 (1999).
- Cho, S. G., et al. Glutathione S-Transferase Mu Modulates the Stress-activated Signals by Suppressing Apoptosis Signal-regulating Kinase 1. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12749-12755 (2001).
- Hayes, J. D., Flanagan, J. U., Jowsey, I. R. Glutathione Transferases. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 45 (1), 51-88 (2005).
- Lo, H. W., Ali-Osman, F. Genetic polymorphism and function of glutathione S-transferases in tumor drug resistance. Current Opinion in Pharmacology. 7 (4), 367-374 (2007).
- Ansari, M., et al. Glutathione S-transferase gene variations influence BU pharmacokinetics and outcome of hematopoietic SCT in pediatric patients. Bone Marrow Transplantation. 48 (7), 939-946 (2013).
- Mahajan, S., Atkins, W. M. The chemistry and biology of inhibitors and pro-drugs targeted to glutathione S-transferases. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 62 (11), 1221-1233 (2005).
- Allocati, N., Masulli, M., Ilio, C. D., Federici, L. Glutathione transferases: substrates, inihibitors and pro-drugs in cancer and neurodegenerative diseases. Oncogenesis. 7 (1), 8 (2018).
- Aggarwal, B. B., Kumar, A., Bharti, A. C. Anticancer potential of curcumin: preclinical and clinical studies. Anticancer Research. 23 (1), 363-398 (2003).
- Han, S. S., Chung, S. T., Robertson, D. A., Ranjan, D., Bondada, S. Curcumin causes the growth arrest and apoptosis of B cell lymphoma by downregulation of egr-1, c-myc, bcl-XL, NF-kappa B, and p53. Clinical Immunology. 93 (2), 152-161 (1999).
- Golonko, A., Lewandowska, H., Świsłocka, R., Jasińska, U. T., Priebe, W., Lewandowski, W. Curcumin as tyrosine kinase inhibitor in cancer treatment. European Journal of Medicinal Chemistry. 181, 111512 (2019).
- Awasthi, S., et al. Curcumin-glutathione interactions and the role of human glutathione S-transferase P1-1. Chemico-Biological Interactions. 128 (1), 19-38 (2000).
- Appiah-Opong, R., Commandeur, J. N. M., Istyastono, E., Bogaards, J. J., Vermeulen, N. P. E. Inhibition of human glutathione S-transferases by curcumin and analogues. Xenobiotica; the Fate of Foreign Compounds in Biological Systems. 39 (4), 302-311 (2009).
- Dubey, V., Owusu-Apenten, R. Curcumin Restores Glutathione-S-Transferase Activity for LNCaP Prostate Cancer Cells. Pure and Applied Chemistry. 2, 61-72 (2014).
- Habig, W. H., Pabst, M. J., Jakoby, W. B. Glutathione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation. The Journal of Biological Chemistry. 249 (22), 7130-7139 (1974).
- Johnson, K. A., Goody, R. S. The Original Michaelis Constant: Translation of the 1913 Michaelis-Menten Paper. Biochemistry. 50 (39), 8264-8269 (2011).
- Ochs, R. S. Understanding Enzyme Inhibition. Journal of Chemical Education. 77 (11), 1453 (2000).
- Bisswanger, H. Enzyme assays. Perspectives in Science. 1 (1), 41-55 (2014).
- Acker, M. G., Auld, D. S. Considerations for the design and reporting of enzyme assays in high-throughput screening applications. Perspectives in Science. 1 (1), 56-73 (2014).
- Cheng, A. L., et al. . Anticancer Research. 21, 2895-2900 (2001).
- Yang, J., Copeland, R. A., Lai, Z. Defining Balanced Conditions for Inhibitor Screening Assays That Target Bisubstrate Enzymes. Journal of Biomolecular Screening. 14 (2), 111-120 (2009).
- Uppugunduri, C. R. S., Muthukumaran, J., Santos-Silva, T., Ansari, M. Identification of putative substrates and inhibitors for Glutathione S-transferases using computational methods. Zenodo. , (2017).
- Burlingham, B. T., Widlanski, T. S. An Intuitive Look at the Relationship of Ki and IC50: A More General Use for the Dixon Plot. Journal of Chemical Education. 80 (2), 214 (2003).
- Wang, Y. J., et al. Stability of curcumin in buffer solutions and characterization of its degradation products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 15 (12), 1867-1876 (1997).
- Copeland, R. A. Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. A guide for medicinal chemists and pharmacologists. Methods of Biochemical Analysis. 46, 1 (2005).
- Kalliokoski, T., Kramer, C., Vulpetti, A., Gedeck, P. Comparability of Mixed IC50 Data – A Statistical Analysis. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
- Brandt, R. B., Laux, J. E., Yates, S. W. Calculation of inhibitor Ki and inhibitor type from the concentration of inhibitor for 50% inhibition for Michaelis-Menten enzymes. Biochemical Medicine and Metabolic Biology. 37 (3), 344-349 (1987).
- Brooks, H. B., et al. Basics of Enzymatic Assays for HTS. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2012).
- Arakawa, S., et al. Evaluation of hepatic glutathione transferase Mu 1 and Theta 1 activities in humans and mice using genotype information. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 40 (3), 497-503 (2012).
- Sherratt, P. J., Pulford, D. J., Harrison, D. J., Green, T., Hayes, J. D. Evidence that human class Theta glutathione S-transferase T1-1 can catalyse the activation of dichloromethane, a liver and lung carcinogen in the mouse. Comparison of the tissue distribution of GST T1-1 with that of classes Alpha, Mu and Pi GST in human. The Biochemical Journal. 326 (3), 837-846 (1997).
