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Biochemistry

Examen espectrofotométrico para posibles inhibidores de la citosola glutatión S-transferasas

Published: October 10, 2020
doi:
10.3791/61347
, ,
1Research platform of Pediatric Onco-Hematology, Department of Paediatrics, Gynaecology and Obstetrics, Faculty of Medicine,University of Geneva, 2Section of Biology, Faculty of Science,University of Geneva, 3Onco-Hematology Unit, Department of Women, Children-Adolescents,University Hospitals of Geneva

Summary

Glutatión S-transferasas (GST) son enzimas de desintoxicación implicadas en el metabolismo de numerosos fármacos quimioterápticos. La sobreexpresión de los GST está correlacionada con la resistencia a la quimioterapia contra el cáncer. Una manera de contrarrestar este fenotipo es usar inhibidores. Este protocolo describe un método que utiliza un ensayo espectrofotométrico para detectar posibles inhibidores del GST.

Abstract

Las S-transferasas de glutatión (GST) son enzimas metabólicas responsables de la eliminación de compuestos electrofílicos endógenos o exógenos por conjugación de glutatión (GSH). Además, los GST son reguladores de las quinasas proteicas activadas por mitógenos (MAPK) implicadas en vías apoptóticas. La sobreexpresión de los GST está correlacionada con una disminución de la eficacia terapéutica entre los pacientes sometidos a quimioterapia con agentes alquilantes electrofífilos. El uso de inhibidores del GST puede ser una solución potencial para revertir esta tendencia y aumentar la potencia del tratamiento. Lograr este objetivo requiere el descubrimiento de estos compuestos, con un ensayo enzimático preciso, rápido y fácil. Un protocolo espectrofotométrico que utiliza 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB) ya que el sustrato es el método más empleado en la literatura. Sin embargo, los experimentos de inhibición del GST ya descritos no proporcionan un protocolo que detalle cada etapa de un ensayo de inhibición óptimo, como la medición de la constante Michaelis-Menten (Km) para CDNB o la indicación de la concentración enzimática empleada, parámetros cruciales para evaluar la potencia de inhibición de un compuesto probado. Por lo tanto, con este protocolo, describimos cada paso de un ensayo de enzimas GST espectrofotométricas optimizados, para examinar bibliotecas de posibles inhibidores. Explicamos el cálculo tanto de la concentración inhibitoria medio-máxima (IC50) como de la constante de inhibición (Ki),dos características utilizadas para medir la potencia de un inhibidor de enzimas. El método descrito se puede implementar utilizando un conjunto de GST extraídos de células o GST humanos recombinantes puros, a saber, GST alfa 1 (GSTA1), GST mu 1 (GSTM1) o GST pi 1 (GSTP1). Sin embargo, este protocolo no se puede aplicar a GST theta 1 (GSTT1), ya que CDNB no es un sustrato para esta isoforma. Este método se utilizó para probar la potencia de inhibición de la curcumina utilizando GSTs del hígado equino. La curcumina es una molécula que exhibe propiedades contra el cáncer y mostró afinidad hacia las isoformas GST después de las predicciones de acoplamiento de silicio. Hemos demostrado que la curcumina es un potente inhibidor de GST competitivo, con un IC50 de 31,6 ± 3,6 m y un Ki de 23,2 ± 3,2 M. La curcumina tiene potencial para combinarse con medicamentos de quimioterapia electrofílica para mejorar su eficacia.

Introduction

Las enzimas citosólicas de glutatión S-transferasa (GSTs, EC 2.5.1.18) catalizan la conjugación de glutatión (GSH) en diversos compuestos electrofífilos, como agentes quimioterápicos, para desintoxicarlos y eliminarlos fácilmente del cuerpo1. Siete isoformas de GST citosólico han sido identificadas como alfa, mu, pi, sigma, omega, theta y zeta. Los GST se expresan principalmente en el hígado, testículos, pulmones, y el tracto gastrointestinal2. La isoforma GST alfa 1 (GSTA1) está muy expresada en hepatocitos. El cuerpo expresa heterogéneamente otros subtipos, incluyendo GST pi 1 (GSTP1) predominantemente en el cerebro, el corazón y los pulmones, y GST mu 1 (GSTM1) en el hígado y los testículos3. Aunque existe una elevada homología de secuencia entre las isoformas del GST, cada una exhibe especificidad del sustrato y está implicada en el metabolismo de los fármacos y el cáncer de diferentes maneras, según su expresión diferencial4,,5.

Compuestos electrofílicos entran en el cuerpo exógenamente o se producen endógenamente. Los pesticidas, prostaglandinas, carcinógenos y medicamentos quimioterapéuticos son algunos de los sustratos potenciales para las reacciones de conjugación de glutatión6. Por ejemplo, cualquier compuesto reactivo con deficiencia de electrones formado dentro de una célula es probable que se convierta en un sustrato electrofífilo. Los agentes alquilantes como el clorambucilo o el melfalán se eliminan como conjugados de GSH catalizado por GST, y el aumento de los niveles de estas enzimas se ha correlacionado con la resistencia a estos compuestos6,,7.

Otro papel importante de los GST citosólicos es regular la actividad de las quinasas proteicas activadas por mitógenos (MAPK) como MAPK8 (también conocida como quinasa C-Jun N-terminal, o JNK1) y MAP3K5 (también conocida como quinasa reguladora de señal de apoptosis 1, o ASK1)8. Algunas isoformas en su conformación monomérica se unirán a estas proteínas y así bloquearán la cascada de fosforilación. En condiciones normales, la isoforma GSTP1 secuestrará MAPK8 (el activador de la proteína c-Jun). La combinación del c-Jun con la proteína c-Fos forma el factor de transcripción de la proteína activadora 1 (AP-1), que es responsable de transcribir genes pro-apoptóticos. En las células estresadas, el complejo formado por GSTP1 y MAPK8 se disocia, c-Jun se activa, y los genes que conducen a la apoptosis comienzan a expresarse9. Por lo tanto, una mayor expresión de esta isoforma del GST podría bloquear la vía, lo que conduce a una mayor viabilidad celular, más proliferación celular y una menor sensibilidad celular a la quimioterapia. Escenarios similares pueden ocurrir con los paralogs de GSTP1, por ejemplo, GSTM1, que interactúa con MAP3K510.

El papel desempeñado por los GST en el metabolismo de los fármacos y en el secuestro de MAPKs llevó a la hipótesis de que una mayor expresión de los GST podría ser un signo de un mecanismo de resistencia tumoral al tratamiento quimioterático6,,11. Por ejemplo, GSTP1 está sobreexpresado en numerosos tipos de cáncer y su presencia se ha correlacionado con un mal pronóstico y una mayor incidencia de recaída8. El polimorfismo en estos genes también ha mostrado tasas diferenciales de exposición a fármacos y supervivencia para los pacientes que presentan diversas enfermedades, reforzando la idea de que estas enzimas son cruciales para los mecanismos de resistencia a los medicamentos. Por ejemplo, los individuos con el genotipo nulo GSTM1 están asociados con una menor eliminación de fármacos y una mejor supervivencia12,,13. Existen varios medios potenciales para contrarrestar esta sobreexpresión, como el uso de análogos GSH, prodrugs que se activan por conjugación con GST, o inhibidores directos del GST14,,15.

Todos estos métodos están actualmente bajo investigación, y algunos compuestos han comenzado ensayos clínicos para su uso potencial entre los pacientes. Sin embargo, hasta el mejor de nuestros conocimientos, no hay compuestos en uso como inhibidores del GST en entornos clínicos15. De hecho, la falta de especificidad de ciertas isoformas o el agotamiento de la GSH en las células normales, que pueden dar lugar a toxicidades causadas por la acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS) en los sistemas de órganos, son sólo algunos de los inconvenientes que reducen el potencial de los inhibidores del GST14,,15. El riesgo de que estos compuestos puedan ejercer otros efectos farmacodinámicos en el cuerpo también están limitando su uso. El ácido etacrílico, por ejemplo, es el inhibidor de GST más ampliamente estudiado en entornos de laboratorio, pero debido a que se utiliza principalmente como un fuerte diurético, esta propiedad limita su uso en combinación con otros fármacos en entornos clínicos. La curcumina es otro compuesto natural con éxito examinado como un inhibidor de GST. Esta molécula es un éter de polifenol extraído de la especie longa de la cúrcuma de la cúrcuma. Ha demostrado resultados prometedores como una posible opción de tratamiento contra el cáncer induciendo la apoptosis de varios tipos de líneas celulares tumorales16,17. El compuesto puede regular diversas vías celulares, como la tirosina quinasa18 o la vía GST. Los estudios con proteínas puras han demostrado su potencia de inhibición en GSTA1, GSTM1 y GSTP119,,20. Sin embargo, se observaron resultados contradictorios en las células cancerosas, donde se midió una mayor actividad del GST intracelular cuando las células fueron tratadas con curcumina21. Por lo tanto, es importante investigar la concentración inhibitora medio-máxima (IC50) y la constante de inhibición (Ki) de cualquier inhibidor de GST putativo utilizando un protocolo claramente descrito con controles adecuados antes de planificar cualquier otro experimento celular.

Por lo tanto, el cribado y las pruebas de nuevos inhibidores del GST son de gran interés clínico, y cualquier nuevo compuesto encontrado debe ser seguro y eficiente para su uso en combinación con fármacos electrofífilos. Centrar la investigación en inhibidores específicos de la isoforma podría permitir la inhibición del GST en los tejidos tumorales que presentan patrones específicos de expresión de GST, permitiendo así el desarrollo de una terapia de combinación eficaz. Encontrar inhibidores con modos diferenciales de inhibición también podría ser de interés. Por ejemplo, un inhibidor competitivo que utiliza GSH como sustrato puede inducir su agotamiento. Esta reducción de la concentración de GSH en las células se demostró para inducir estrés oxidativo en las neuronas, conduce a la apoptosis. Otro modo común de inhibición, la inhibición no competitiva, no se puede revertir incluso si el sustrato está presente en altas concentraciones.

La velocidad de actividad enzimática está representada por la constante Michaelis-Menten (Km)y la velocidad máxima (Vmax), que se puede determinar trazando un gráfico Michaelis-Menten, con la concentración de sustrato frente a la velocidad de la reacción23. Km es la concentración de sustrato necesaria para ocupar la mitad de los sitios activos enzimáticos, lo que significa que un Km alto representa menos afinidad. Vmax representa la velocidad máxima de la reacción, alcanzada cuando todos los sitios activos están ocupados por el sustrato. Km es igual a la mitad Vmáx. Hay tres modos de inhibición más comunes: competitivo, poco competitivo y no competitivo. En caso de inhibición competitiva, el inhibidor se une al sitio activo de la enzima y compite con el sustrato. Por lo tanto, Vmax no cambia después de la adición del inhibidor, pero Km aumenta, ya que se necesita más sustrato para contrarrestar la inhibición. La inhibición no competitiva ocurre sólo cuando el sustrato forma un complejo con la enzima. En este caso, como el nivel de inhibición depende del sustrato y la concentración enzimática, Vmax y Km disminuyen cuando el inhibidor se añade a la reacción. El último modo de inhibición no es competitivo y es una mezcla de los otros dos patrones de inhibición. El inhibidor puede unirse al sitio activo de la enzima, independientemente de si la enzima está unida a su sustrato o no. Aquí Vmax disminuye después de la adición del inhibidor, pero Km no cambia24.

Un ensayo espectrofotométrico que midió la actividad del GST fue desarrollado por primera vez por Habig et al. en 1974 utilizando 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB) como sustrato para la reacción22. Conjugación entre GSH y CDNB formas GS-DNB, que exhibe una máxima absorción de luz en la longitud de onda de 340 nm, grabable con un espectrofotómetro. La mayor parte de la técnica que se explica a continuación se deriva de Habig et al., incluyendo información sobre los mejores ajustes y puntos de optimización importantes para un ensayo inhibitorio. La técnica se puede aplicar a los posibles inhibidores del GST, ya sea elegidos por la selección racional de fármacos mediante predicciones computacionales o por revisión de la literatura. También se discute cómo adaptar el protocolo a proteínas GST recién sintetizadas o isoformas específicas. Por ejemplo, probar la potencia inhibitoria de las isoformas del GST que presentan un polimorfismo clínicamente relevante o de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) podrían ser usos potenciales de este protocolo, dirigidos a GST específicos del paciente.

Este protocolo proporciona un método rápido, factible y eficaz para el cribado de posibles inhibidores del GST in vitro antes de cualquier otro estudio funcional. Se describen los pasos necesarios para evaluar las características más comúnmente medidas de un inhibidor enzimático: la concentración inhibitorina 50 (IC50) que es la concentración de inhibidor necesaria para disminuir la actividad enzimática a la mitad; y la constante de inhibición (Ki) que representa la constante de equilibrio de la disociación entre el inhibidor y la enzima, característica de la afinidad entre estas dos moléculas. Estos dos valores se miden por regresión no lineal y utilizando ecuaciones específicas para cada modo de inhibición, respectivamente. También demostramos la evaluación de este patrón de inhibición, utilizando las parcelas de Michaelis-Menten para determinar el cambio de Vmax y Km después de la adición del inhibidor23,25,26.

Protocol

1. Preparación de la solución enzimática GST NOTA: El procedimiento para preparar la solución enzimática depende de si las unidades de actividad enzimática se conocen o no antes del ensayo. Una unidad enzimática es la cantidad de enzima necesaria para sintetizar 1 émol de producto por minuto. La actividad enzimática se representa en unidad/ml o en el ommol/min/ml y depende de la dilución de la solución enzimática. La actividad enzimática específica se representa en unidad/mg o émol/min/mg y depende únicamente de la pureza de la solución. Ambas características se determinan a continuación. Si se desconoce la unidad enzimática de una isoforma GST aislada, debe estimarse ajustar las concentraciones enzimáticas para cada reacción y proporcionar resultados reproducibles. Si se conoce la unidad enzimática del GST utilizado en el ensayo: Preparar una solución de stock fresco de la enzima GST a 0,1 U/ml en agua y, a continuación, proceder con el paso 2.NOTA: Esta solución se puede almacenar a -20 oC en alícuotas durante varios meses o a -80 oC durante períodos más largos, pero se debe evitar el ciclo de congelación/descongelación. Si se desconoce la unidad enzimática del GST utilizada en el ensayo: Cuantifique la concentración de proteínas de la solución enzimática utilizando un ensayo proteico de ácido bicinchoninico (BCA) o cualquier otro kit. Diluir la solución proteica a una concentración final de proteína de 0,02 mg/ml. Añadir 20 ml de la solución enzimática, 20 ml de GSH 25 mM (peso molecular: 307,32 g/mol) y 150 l de solución salina tamponada en fosfato (DPBS) de Dulbecco a una placa de 96 pocillos. Para el espacio en blanco, agregue 20 l de agua en lugar de la solución enzimática. Añadir 10 l de sustrato de CDNB 50 mM (peso molecular: 202,55 g/mol) a cada pocól. En un lector de microplacas espectrofotométricas, establezca los parámetros para leer los pozos en 340 nm. Se recomienda medir la absorbancia cada minuto durante 10 minutos. Inserte la placa en el lector de microplacas e inicie la lectura de acuerdo con los ajustes del paso 1.2.5. Calcule el cambio en la absorbancia por minuto para las muestras enzimáticas y el espacio en blanco.NOTA: Compruebe que la reacción es lineal trazando la absorbancia en el eje Y y los minutos en el eje X. Si la reacción no es lineal y llega a una meseta, significa que se utiliza todo el sustrato y la reacción es demasiado rápida. Por lo tanto, reducir la cantidad de enzima añadida al pozo mediante la dilución de la solución de stock en dos. Corrija en blanco las lecturas de absorbancia de las muestras de prueba. Con la ecuación 1, que representa la ley Cerveza-Lambert, calcular la concentración de GS-DNB formada (en M) por la reacción cada minuto.Ecuación 1:donde C es la concentración del sustrato en M, A340/min es el cambio en la absorbancia por minuto, medido en el paso 1.2.7, ε es el coeficiente de extinción molar para el conjugado CDNB a 340 nm (0.0096-M-1*cm-1), y l es la longitud de la trayectoria de la luz en el pozo (en cm). Para una placa de 96 pocillos llena de 200 ml de solución enzimática, la longitud del trayecto es de alrededor de 0,55 cm. Este valor puede variar según el modelo de placa y debe verificarse con el fabricante. Para determinar la cantidad de producto presente en un pozo en émol/min, multiplique los resultados encontrados usando la ecuación 1 por el volumen de la solución, 2 x 10-4 L. Normalizar la actividad por cantidad de proteína utilizada dividiendo los resultados del paso 1.2.9 por 4 x 10-4 mg. El resultado es la actividad enzimática específica en unidad/mg o émol/min/mg.NOTA: Si la dilución se modificó en el paso 1.2.6, debido a una reacción no lineal, ajuste la cantidad de proteína en consecuencia. Para encontrar la actividad enzimática, ajuste los resultados a la concentración de proteínas en mg/ml multiplicando la actividad enzimática específica que se encuentra en el paso 1.2.10 por 0,002 mg/ml. Esto dará la actividad enzimática en unidad/ml o émol/min/ml.NOTA: A diferencia de la actividad enzimática, esta medida no cambiará dependiendo de la dilución de la solución proteica. Nota igual que el paso 1.2.10 pero para la concentración de proteínas. Preparar una solución en stock de la enzima GST a 0,1 unidad/ml en agua y, a continuación, continuar con el paso 2.NOTA: Esta solución se puede almacenar a -20 oC en alícuotas durante varios meses o a -80 oC durante períodos más largos, pero se debe evitar el ciclo de congelación/descongelación. Se recomienda controlar la actividad enzimática si los experimentos se llevan a cabo durante un período prolongado de tiempo, ya que puede producirse una degradación de la solución proteica. 2. Medición de la constante Michaelis-Menten de la isoforma GST para CDNB NOTA: El procedimiento se explica para un sustrato CDNB, pero se puede aplicar a cualquier otro sustrato, como GSH. Cada concentración de CDNB necesita su propio espacio en blanco, ya que la absorbancia a 340 nm aumentará de acuerdo con la concentración de CDNB. Preparar seis concentraciones diferentes de CDNB, que van desde 10 mM a 100 mM, en etanol 95% (v/v). Preparar la solución de ensayo, con 10 ml de CDNB, 20 ml de enzima GST, 20 l de GSH 25 mM y DPBS de 150 l. Para el espacio en blanco, en lugar de la solución CDNB, agregue sólo 10 l de etanol 95%. Preparar un espacio en blanco para cada concentración de CDNB, con 10 s de CDNB, 20 ml de agua, 20 ml de GSH 25 mM y DPBS de 150 l. Registre la absorbancia a 340 nm cada minuto durante 10 minutos con un lector de microplacas. Corrija en blanco la absorbancia restando los resultados del espacio en blanco del de los otros pozos de prueba correctos. De acuerdo con los valores medidos, calcule la velocidad de la reacción usando la Ecuación 2.Ecuación 2:donde A340/min es el cambio experimentalmente determinado en absorbancia por minuto,el total V (volumen total) equivale a 0,2 ml, laenzima V (volumen de enzima) es de 0,02 ml y εGS-DNB es el coeficiente de extinción molar del conjugado GS-DNB a 340 nm (9,6 mM-1*cm-1). En un pozo de 200 l de una placa de 96 pocillos, la longitud del trayecto es de 0,55 cm (dependiendo del tipo de placa) y el coeficiente de extinción es igual a 5,3 mM-1. La velocidad se puede representar ya sea por el tipo de la velocidad de la temperatura de la temperatura de la temperatura de la velocidad o de mM/min. Trazar el gráfico Michaelis-Menten con la velocidad (en el eje Y) contra la concentración del sustrato (en el eje X). Definir la velocidad máxima (Vmax) de la reacción y la constante Michaelis-Menten (Km) (es decir, la concentración del sustrato a la mitad de Vmáx.).NOTA: Utilizando software como GraphPad Prism, la curva cinética enzimática se puede ajustar utilizando una regresión no lineal para el cálculo de los parámetros cinéticos de la enzima Michaelis-Menten, como Vmax y Km. Preparar una solución de stock CDNB a 20 veces el Km calculado en etanol 95% (v/v). 3. Absorbencia del posible inhibidor del GST NOTA: Este paso se realiza para investigar si el posible inhibidor del GST utilizado en la reacción produce un metabolito que aumenta la absorbancia en la longitud de onda que se mide. Si lo hace, la cantidad de inhibidor utilizado tendrá un impacto en los resultados y se debe preparar un espacio en blanco específico para cada concentración. Diluir el inhibidor a las concentraciones requeridas.NOTA: Prepare tres diluciones diferentes, preferiblemente las concentraciones más bajas, medias y más altas probadas durante el ensayo de inhibición. La concentración máxima de DMSO en el pozo debe ser igual o inferior al 1% (v/v). Probamos el efecto de la concentración de DMSO en el ensayo en nuestro laboratorio, y el 1% no cambió significativamente la actividad del GST. En una placa de 96 pocillos, agregue 2 l del inhibidor potencial de GST, 20 l de GSH 25 mM y 168 l de DPBS. Utilice un control adecuado, sin inhibidor, añadiendo volúmenes iguales del disolvente utilizado para las muestras del inhibidor. Incubar la reacción durante 10 minutos, para iniciar la reacción enzimática.NOTA: Este paso se puede optimizar, probando diferentes tiempos de incubación, con los dos objetivos de iniciar la reacción evitando el agotamiento total del sustrato. Añadir 10 l de CDNB a cada pocódico para lograr una concentración final en el Km que se encuentra en el paso 2. Agitar el plato durante unos segundos. Registre la absorbancia a 340 nm cada minuto durante 10 minutos con un lector de microplacas. Calcule el cambio en la absorbancia por minuto. Verifique el cambio en la absorbancia en comparación con la reacción en blanco y la reacción de control negativo sin inhibidor. Si hay un cambio significativo, utilice en blanco para cada concentración de inhibidor con el fin de ajustar los resultados.NOTA: Este resultado indica que los componentes de la reacción, sin enzima GST, reaccionan espontáneamente y producen un metabolito que aumenta la absorbancia a 340 nm. Para corregir esta absorbancia adicional, se debe medir un espacio en blanco específico para cada concentración. Si no hay ningún cambio significativo en la absorbancia, utilice un espacio en blanco general, que contenga únicamente el disolvente utilizado para la dilución del inhibidor del GST, para todas las concentraciones. 4. Ensayo de inhibición de la evaluación del GST y del IC50 Preparar nueve concentraciones del posible inhibidor del GST.NOTA: Las concentraciones se pueden adaptar según los resultados. El objetivo es definir las mesetas inferior y superior de la curva de regresión no lineal. Consulte la sección de discusión para obtener más detalles sobre este paso. Preparar la solución de ensayo diluyendo 20 l de la solución GSH a 25 mM con 148 l de DPBS. Adaptar el volumen de acuerdo con el número de pozos utilizados en el ensayo. En una placa transparente de 96 pocillos, prepare la reacción enzimática en un volumen final de 190 l. Se recomienda utilizar una pipeta multicanal para estos pasos. Para los pozos de ensayo, añada 20 ml de la solución enzimática, 2 l de la posible solución inhibidora del GST y 168 l de la solución del ensayo. Para el control, añada 20 l de la solución enzimática, 2 l del diluyente utilizado para el inhibidor de GST y 168 l de la solución del ensayo. Para los pocóculos en blanco, añada 20 l de agua, 2 l del inhibidor potencial de GST y 168 l de la solución del ensayo.NOTA: Si el inhibidor GST absorbe la longitud de onda de 340 nm, se debe preparar un espacio en blanco específico para cada concentración probada. Agregue 10 l de la solución CDNB a 20x Km a cada pocól, incluido el espacio en blanco. Se recomienda utilizar una pipeta multicanal para este paso. Agitar el plato durante unos segundos. Mida la absorbancia a 340 nm cada minuto durante 10 minutos con un lector de microplacas. Corrija en blanco la absorbancia restando los resultados de los espacios en blanco del pozo de prueba. Normalizar los resultados dividiendo los valores obtenidos utilizando la solución inhibidora del GST por la absorbancia por minuto del control sin inhibidor. Trazar los gráficos de regresión no lineales de la concentración logarítmica (eje x) del inhibidor contra la actividad del GST (eje Y) y así determinar el IC50.NOTA: GraphPad Prism calcula el IC50 a partir de las gráficas de regresión no lineales prediciendo la concentración que mostrará el 50% de la actividad enzimática en el control. La predicción se basa en las mesetas inferior y superior, así como en la curva de la pendiente formada por el gráfico sigmoideo. 5. Evaluación de la Kiy el tipo de inhibición Preparar cuatro concentraciones diferentes de CDNB: tres más altas y una igual a la Km encontrada anteriormente. Preparar tres concentraciones diferentes de inhibidores de GST, igual o inferior al IC50 previamente encontrado. Realice el ensayo de inhibición descrito en los pasos 4.2 a 4.7. Calcular la velocidad de las reacciones utilizando la ecuación 2. Trazar los gráficos Michaelis-Menten para cada concentración de inhibidor y calcular el Vmax y Km de cada reacción. De acuerdo con los cambios en Vmax y Km cuando se utilizan diferentes concentraciones, evaluar el modo de inhibición del inhibidor de GST.NOTA: Este paso se explica con más detalle en las secciones de resultados y discusión. Sobre la base del modo de inhibición, calcule el Ki.NOTA: En GraphPad Prism, se utilizarán diferentes ecuaciones para calcular la Ki de acuerdo con la naturaleza de la inhibición. Las ecuaciones utilizadas se basan en el Km yV máximo observados después de la adición del inhibidor y en comparación con Km y Vmáx.del control.

Representative Results

Constante Michaelis-Menten (Km) de CDNB con GST del hígado equinoLa curcumina es un compuesto natural seguro incluso después de la ingestión en dosis más altas27 que mostraron propiedades anticancerígenas16. La potencia inhibitorio de esta molécula se ha demostrado en GSTs recombinantes humanos19,20. Mediante el uso del protocolo descrito, evaluamos el efecto de la curcumina sobre la actividad GST utilizando un conjunto de isoformas GST del hígado equino. Según el proveedor, la actividad específica de esta mezcla de proteínas es de 25 U/mg. Se preparó una solución de 0,1 U/ml disolviendo el polvo liofilizado en la cantidad adecuada de agua. El ácido etacrílico se utilizó en paralelo como un control positivo, ya que este compuesto es el inhibidor de GST más utilizado en estudios. En la Figura 1se describen los pasos para establecer un ensayo de actividad GST y pruebas de inhibidores. El Km debe definirse para cada reacción de sustrato enzimático porque el uso de la concentración de sustrato equivalente a Km no garantizaría ningún sesgo con respecto a la determinación del modo de inhibición28. Se probaron seis concentraciones diferentes de CDNB, que van desde 0,5 mM a 5 mM, para medir este parámetro, utilizando una concentración fija de 2,5 mM GSH. El volumen final de la reacción fue de 200 l, en una placa de 96 pocillos. Se utilizó un espacio en blanco específico para cada experimento, utilizando la misma concentración de CDNB que el pozo de prueba porque la conjugación espontánea de CDNB y GSH podría ocurrir y podría aumentar la absorbancia. Para todas las reacciones se utilizó una concentración final de enzimas de 0,01 unidades/ml, añadiendo 20 ml de la solución de stock a la mezcla de ensayo. La absorción a 340 nm se registró cada minuto durante 10 minutos. La velocidad (en mM/min) de la reacción se calculó utilizando la Ecuación 2. Se trazaba un gráfico Michaelis-Menten de la concentración del sustrato (mM) frente a la velocidad (M/min) (Figura 2), y se calculó el Km de la reacción. El experimento se repitió hasta que al menos tres conjuntos de datos mostraron resultados similares. El Km de CDNB con GST del hígado equino se midió como 0,26 ± 0,08 mM. Se utilizó una concentración de 0,2 mM de CDNB para cada ensayo inhibitorio utilizando este lote de GST. No se midió ninguna formación espontánea de un metabolito que absorbió a 340 nm durante los experimentos con curcumina incubada sola con GSH y CDNB. Se utilizó el mismo espacio en blanco para cada concentración de inhibidores en cada experimento. Potencia inhibitorio de la curcumina en GSTsPotencia inhibitorio de la curcumina se predijo utilizando una simulación de acoplamiento en silicio con software (por ejemplo, AutoDock Vina versión 1.1.2). 29 Se predijo la energía de unión libre entre diferentes isoformas GST (a saber, GSTA1, GSTM1 y GSTP1) y la curcumina (datos no mostrados). Entonces, la constante de inhibición Ki se calculó usando la Ecuación 3. Ecuación 3:donde ∆G es la energía de unión libre que se encuentra utilizando el análisis in silico, R es la constante de gas de 1.987 cal*K-1*mol-1, y T es la temperatura durante el experimento, en este caso en Kelvin (298 K). Sobre la base de los resultados de energía de unión libres devueltos por el AutoDock Vina, la curcumina es un potente inhibidor de GST de GSTA1, GSTM1 y GSTP1 humano, con valores Ki de 78,1 m, 78,1 m y 27,4 m respectivamente. Los primeros ensayos inhibitorios se llevaron a cabo utilizando estas estimaciones computacionales de Ki, y las concentraciones se ajustaron de acuerdo con los resultados, si fuera necesario. En primer lugar, se estimó el IC50. Esta característica es la concentración de inhibidor que reduce la tasa de reacción de una enzima en un 50%. Por lo tanto, depende de la concentración enzimática30. Se prepararon nueve concentraciones finales del inhibidor, que oscilaron entre 0,39 oM y 100 m, con cada concentración el doble que la anterior. La solución del ensayo se compuso de 20 l de GSH 2,5 mM, 20 ml de GST del hígado equino a 0,01 U/ml final, 2 l de la solución de curcumina y 148 l de PBS. El control se componía de la misma solución con el diluyente utilizado para la curcumina. Esta mezcla fue incubada durante 15 minutos para comenzar el ensayo enzimático y evitar la degradación de la curcumina en la solución de ensayo, ya que este compuesto es inestable en las soluciones tampón31. A continuación, se añadieron 10 l de solución DE CDNB a 4 mM a cada pocól, para una concentración final de 0,2 mM de CDNB. La absorción a 340 nm se registró cada minuto durante 10 minutos, para calcular los cambios en la absorbancia por minuto. Para calcular el IC50, cada muestra incubada con curcumina se normalizó al control, para dar el porcentaje de actividad. Estos resultados se analizaron utilizando el software de trazado calculando la regresión no lineal de la concentración logarítmica del inhibidor frente a la inhibición. El IC50 encontrado para la curcumina en GST del hígado equino fue 31.6 ± 3.6 M (Figura 3A). El mismo experimento se llevó a cabo en paralelo utilizando ácido etacrílico como un control positivo, con concentraciones que van desde 0.39 a 100 m, como con la curcumina. Se encontró que el IC50 era de 6,6 ± 1,1 m(Figura 3B). El siguiente paso fue evaluar el modo de inhibición de la curcumina en estas transferencias. Cuatro concentraciones diferentes de curcumina fueron probadas: 0, 7.5, 15, y 30 M, junto con cuatro concentraciones diferentes de CDNB: 0.2, 0.4, 1, y 1.5 mM. El protocolo era el mismo que para el experimento anterior. La velocidad de cada condición se calculó utilizando la Ecuación 2. Se desafió una curva para cada concentración de inhibidor, con la velocidad (en M/min) frente a la concentración del sustrato (mM) (Figura 3C). El Vmax y el Km se determinaron en base a cada parcela con GraphPad Prism. El modo de inhibición del inhibidor potencial se evaluó de acuerdo con los cambios en estos dos parámetros y la condición diferente de los ensayos. 24 Como Vmax no cambió significativamente entre las condiciones, pero Km aumentó con las diferentes concentraciones de inhibidores, inhibición de la curcumina de GSTs es competitiva. Este patrón de inhibición se produce cuando el inhibidor compite con el sustrato para el sitio activo de la enzima. Para medir la Ki de un inhibidor competitivo, GraphPad utiliza la Ecuación 4 y la Ecuación 5 como se describe en Copeland et al.32.Ecuación 4:Ecuación 5:donde Km obs es la constante Michaelis-Menten observada, Km es la constante Michaelis-Menten del control,[I] es la concentración del inhibidor, Ki es la constante de inhibición, Y es la velocidad, y X es la concentración del sustrato. Los cálculos se basan en los mismos experimentos que la evaluación del modo de inhibición. El Ki estimado para la inhibición de la curcumina de GST del hígado equino fue 23.2 ± 3.2 M. Figura 1: Diagrama de flujo que describe los pasos de los ensayos enzimáticos y de inhibición del GST. Los detalles sobre el procedimiento se presentan en la sección del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Gráfica Michaelis-Menten de la actividad enzimática GST. El aumento de la concentración del sustrato CDNB se utilizó con una concentración fija de GSH (2,5 mM) para determinar la actividad de GST a partir de un conjunto de GST del hígado equino. El valor Km para CDNB se determinó como 0,26 ± 0,08 mM según la curva del gráfico. Cada punto de datos en la gráfica representa la media de cuatro corridas experimentales diferentes con SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Efecto de la curcumina y ácido etacránico en la actividad de la enzima GST. (A-B) Adición de concentraciones crecientes de curcumina (A) o el control positivo ácido etacrínico (B), manteniendo el mismo GST (0.01 U/mL), GSH (2.5 mM) y CDNB (0.2 mM) concentraciones finales se utilizaron para calcular el IC50 de ambos compuestos para GST del hígado equino con una regresión no lineal. IC50 se determinó como 31,6 ± 3,6 m para la curcumina y 6,6 ± 1,1 m para el ácido etacrínico. (C) Michaelis-Menten gráfica de diferentes concentraciones de curcumina, probado contra diferentes concentraciones de sustrato de CDNB que indica un modo competitivo de inhibición. Sin inhibidor, Vmax y Km se midieron como 132,7 ± 4,6 oM y 0,5 ± 0,08 oM, respectivamente. Con 30 m de curcumina, Vmax y Km fueron 130,4 ± 13,1 m y 1,08 ± 0,39 m. Los puntos de datos en todos los gráficos(A-C) representan los medios de tres corridas experimentales diferentes con SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Proporcionamos un protocolo que describe cada paso de un ensayo de enzimas GST espectrofotométricas, para examinar los inhibidores putativos (Figura 1, Tabla 1) y cuantificar su potencia inhibitoria. También enfatizamos los criterios más cruciales a tener en cuenta para los ensayos enzimáticos precisos que proporcionan resultados reproducibles. Las principales ventajas del protocolo descrito sobre otros métodos colorimétricos o espectrometría de masas es que este protocolo es rápido y fácil de realizar y proporcionar mediciones cuantitativas de la actividad GST, así como la potencia de inhibición de moléculas cribadas.

Presentamos la forma de calcular los dos parámetros más importantes de Michaelis-Menten de un inhibidor de enzimas: el IC50 y el Ki. Un inhibidor potente ejercerá el menor posible Ki y IC50, lo que indica que la afinidad entre el inhibidor y la enzima es alta30. Dado que IC50 depende de la concentración de enzimas y de las condiciones del ensayo33, puede ser difícil utilizar este valor para comparar inhibidores de diferentes experimentos u obtenidos utilizando otras condiciones de ensayo34. El uso de la constante de inhibición Ki es un mejor indicador de la potencia inhibitorio de los compuestos potenciales. Ki se puede utilizar para comparar dos inhibidores con diferentes modos de inhibición, ya que se basa únicamente en la afinidad entre el inhibidor y la enzima. Sin embargo, para tener una idea clara de la naturaleza de la inhibición se debe determinar ambos parámetros del inhibidor30. Medimos IC50 y Ki de las curcuminas como 31,6 ± 3,6 m y 23,2 ± 3,2 M, respectivamente, lo que indica que este compuesto es un potente inhibidor del GST. Estos resultados confirmaron las predicciones in silico, que estimaron los valores de Ki entre 27,4 y 78,1 m para diferentes isoformas y curcumina GST humanas.

Actividad enzimática o tasa de reacción y cantidad de enzima
Como se indicó anteriormente, IC50 depende de la concentración de enzimas, y la realización de un experimento con un nivel desconocido de actividad enzimática podría conducir a conclusiones falsas33. Para controlar otros factores, que podrían reducir la actividad inhibitorio, se debe considerar y medir la actividad enzimática para cada nuevo lote de GST. Por ejemplo, la degradación de un lote enzimático, causada por demasiados ciclos de congelación/descongelación, podría disminuir la actividad y, por lo tanto, provocar un IC50 más bajo incluso si el experimento se ejecutó en las mismas condiciones. En otras palabras, el uso de 0,01 unidades de enzima no dará los mismos resultados que el uso de 1 unidad. El uso de demasiadas enzimas podría conducir a un rápido agotamiento del sustrato y la reacción no tendrá una forma lineal. Por lo tanto, este parámetro podría dar lugar a resultados inexactos, ya que no se observaría ningún cambio en la absorbancia después de un largo tiempo de incubación.

Km Valor
Para garantizar las mejores condiciones para evaluar el tipo de inhibición exhibida por un inhibidor, la concentración del sustrato debe ser igual o inferior a la constante Michaelis-Menten (Km). Km está representado por la concentración de sustrato necesaria para ocupar la mitad de los sitios activos en la enzima28. Por ejemplo, una mayor concentración de sustrato puede contrarrestar un inhibidor competitivo y evaluar este tipo de inhibición será difícil en este entorno. Por lo tanto, uno de los pasos cruciales en esta metodología es la determinación de la enzima Km para el sustrato seleccionado (aquí CDNB). En algunos estudios, este valor no se determinó y esto podría conducir a conclusiones falsas sobre el patrón de inhibición causada por el inhibidor, y, si el modo de inhibición es incorrecto, el Ki se calculará incorrectamente ya que la ecuación se basa en el patrón de inhibición26,28. Si se prueba una isoforma GST diferente, una nueva evaluación del valor Km es obligatoria, ya que este valor es único para un par de enzimas y ligandos. Como usamos una concentración de CDNB ligeramente inferior a la Km (0,2 mM), que definimos como 0,26 ± 0,08 mM, se determinó con precisión el modo competitivo previsto de inhibición de la curcumina en GST.

IC50
Obtener una buena curva sigmoidal con la que estimar el IC50 requiere encontrar las mesetas inferior y superior. La meseta inferior representa las concentraciones de un inhibidor que proporcionan la máxima actividad inhibitora. En algunos casos, un compuesto podría no inhibir la enzima completamente, incluso en altas concentraciones, debido a problemas técnicos como la solubilidad. Sin embargo, herramientas como GraphPad Prism pueden adaptarse a la meseta inferior con bastante precisión. La meseta superior se compone de concentraciones del inhibidor, que son insuficientes para inhibir la enzima, y por lo tanto la actividad es máxima. Ambas mesetas son cruciales para determinar el IC50, así como las concentraciones en el medio, con el fin de encontrar la pendiente de la curva, entonces el IC50 se puede derivar de la forma de la curva sigmoide35. La curcumina es poco soluble en agua, por lo tanto la concentración máxima utilizada en este ensayo es limitada, para evitar precipitaciones en la solución de ensayo. Por lo tanto, se utilizaron soluciones menos concentradas, que no inhibe completamente la actividad del GST. Esto planteó problemas para la determinación de la meseta inferior. Para contrarrestar este problema, predijimos valores inferiores basados en el gráfico de regresión no lineal, que proporcionó un IC50 de 31,6 ± 3,6 m para la curcumina (Figura 3A). En el caso del ácido etacrílico, no hubo necesidad de predecir los valores de la meseta inferior, ya que este compuesto es soluble en la solución de ensayo y el IC50 se midió a 6,6 ± 1,1 oM.

Este método se puede aplicar a las isoformas GST más expresadas en humanos, a saber, GSTA1, GSTM1 o GSTP1. Sin embargo, este protocolo no es adecuado para cuantificar la actividad de la isoforma GSTT1, ya que CDNB no es un sustrato para este subtipo. 36, 37 Mientras tanto, el protocolo se puede modificar ligeramente para contrarrestar este problema. Por ejemplo, utilizando 1,2-epoxi-3-(4′-nitrofenoxi)propano (ENPP) como sustrato para GSTT1 y medir la cantidad de conjugado a 360 nm en lugar de 340 nm. 37

Los pasos del protocolo pueden ser los adaptados y aplicados para probar la actividad del GST y las pruebas de inhibidores en experimentos de cultivo celular. La medición de la actividad del GST en células tratadas con y sin un inhibidor de GST indicará si este compuesto se puede utilizar en dicho entorno experimental. Es especialmente interesante cuando el inhibidor es lipofílico. Por ejemplo, presentamos que la curcumina es un potente inhibidor de GST utilizando este protocolo. Sin embargo, su aplicación a los estudios celulares puede ser limitada, ya que la molécula es poco soluble en agua y se degrada rápidamente en medio. 31 Otra mejora de este protocolo es posible con respecto a la especificidad no isóforma del sustrato CDNB. El uso de este protocolo en estudios celulares solo proporcionará información sobre la actividad general del GST, pero no sobre la actividad del subtipo GST preciso. La adición de sustrato específico de isoforma y/o el uso de isoforma GST recombinante específica permitirá probar inhibidores de GST específicos de isoforma.

Para concluir, describimos un procedimiento completo para probar los inhibidores del GST que tienen potencial para ser utilizados en combinación con quimioterapia electrofílica. Destacamos los pasos cruciales de una enzima GST y un ensayo de inhibición, para probar moléculas interesantes potenciales y determinar su eficiencia como inhibidor con valores cuantitativos, el IC50 y el Ki. Este método se puede aplicar a cualquier compuesto putativo y realizarse en las isoformas GST humanas más expresadas (GSTA1, GSTM1 y GSTP1), o ligeramente adaptado para realizar estudios de cultivo celular con inhibidores del GST o medir la actividad de otras isoformas interesantes de GST de elección.

Reactivos Nombre Concentración en la solución del ensayo Otro
Sustrato CDNB Km medido (mM) Diluido en 95% etanol. La concentración final de etanol debe ser ≤ 5% (v/v)
Sustrato conjugador Gsh 2,5 mM Diluido en agua.
La concentración debe saturar la solución.
Búfer Pbs – pH 7,1
Enzima Grupo de isoformas GST o isoforma pura 0.01 unidad/ml, determinado experimentalmente. Diluido en agua.
Inhibidor GST Compuesto potencial de elección IC50: 3 concentraciones que inhiben al máximo, 3 que inhiben mínimamente, y 3 en el medio. Diluido en DMSO y luego en agua, para tener una concentración final de DMSO ≤ 1% (v/v)
Ki: 3 concentraciones alrededor del IC50.
Parámetros
Temperatura ambiente (25oC)
pH 7,1
DMSO ≤ 1% (v/v)
≤ de etanol 5% (v/v)

Tabla 1: Resumen de los reactivos y parámetros a tener en cuenta durante un ensayo de inhibición del GST.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo de investigación fue apoyado por la Fundación CANSEARCH. Los autores desean reconocer a la Sra. Laurence Lesne y al Sr. Yoann Sarmiento por su asistencia técnica, especialmente en la realización de los experimentos de replicación mientras estandarizan los ensayos con inhibidores. Se reconocen en gran medida los fructíferos debates y aportaciones del Sr. Denis Marino, la Dra. Simona Mlakar y la Dra. Vid Mlakar. Agradecemos a la Dra. Patricia Huezo-Diaz Curtis por su ayuda con la narración del video. Agradecemos al Dr. Muthukumar por sus aportaciones en las predicciones de silicio. También agradecemos al Sr. Darren Hart su ayuda en la lectura de pruebas en inglés de este manuscrito.

Materials

1-Chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) Sigma-Aldrich 237329 Substrate used for the GST enzymatic assay
Corning UV-Transparent Microplates Sigma-Aldrich CLS3635 Transparent plate to perform the enzymatic assay.
When using 200 ul, the pathlength is 0.552 cm for this plate.
Curcumin Sigma-Aldrich 8511 Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 To prepare the stock of the putative inhibitor
DPBS Sigma-Aldrich D8537 Buffer for the enzymatic reaction
Ethanol 95% Fisher scientific 10542382 To dilute the CDNB
Glutathione S-Transferase from equine liver Sigma-Aldrich G6511 Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin
L-glutathione reduced (GSH) Sigma-Aldrich G4251 Co-substrate for the GST enzymatic assay
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23225 To quantify the amount of protein present in the enzymatic solution
Spectramax iD3 Molecular devices To do spectrophotometric measurments
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Robin, S. K. D., Ansari, M., Uppugunduri, C. R. S. Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases. J. Vis. Exp. (164), e61347, doi:10.3791/61347 (2020).
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