JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

הקרנה ספקטרופוטומטרית עבור מעכבים פוטנציאליים של גלוטתיון ציטוסולי S-Transferases

Published: October 10, 2020
doi:
10.3791/61347
, ,
1Research platform of Pediatric Onco-Hematology, Department of Paediatrics, Gynaecology and Obstetrics, Faculty of Medicine,University of Geneva, 2Section of Biology, Faculty of Science,University of Geneva, 3Onco-Hematology Unit, Department of Women, Children-Adolescents,University Hospitals of Geneva

Summary

גלוטתיון S-transferases (GSTs) הם אנזימי גמילה מעורב בחילוף החומרים של תרופות כימותרפיות רבות. דיכוי יתר של GSTs הוא בקורלציה עם התנגדות כימותרפיה סרטן. דרך אחת להתמודד עם פנוטיפ זה היא להשתמש במעכבים. פרוטוקול זה מתאר שיטה באמצעות אסיוג ספקטרופוטומטרי כדי לסנן מעכבי GST פוטנציאליים.

Abstract

גלוטתיון S-transferases (GSTs) הם אנזימים מטבוליים האחראים לחיסול של תרכובות אלקטרופיליות אנדוגניים או אקסוגניים על ידי התייחדות גלוטתיון (GSH). בנוסף, GSTs הם רגולטורים של קינאז חלבון המופעל על ידי מיטוגן (MAPKs) המעורבים במסלולים אפופטוטיים. דיכוי יתר של GSTs הוא בקורלציה עם יעילות טיפולית מופחתת בקרב חולים שעברו כימותרפיה עם חומרים אלקטרופיליים alkylating. שימוש מעכבי GST עשוי להיות פתרון פוטנציאלי כדי להפוך את הנטייה הזאת ועוצמת טיפול מוגבר. השגת מטרה זו דורשת גילוי של תרכובות כאלה, עם גישה מדויקת, מהירה וקלה לאנזים. פרוטוקול ספקטרופוטומטרי באמצעות 1-כלורו-2,4-dinitrobenzene (CDNB) כמו הצוללת היא השיטה המועסקת ביותר בספרות. עם זאת, כבר מתוארים ניסויי עיכוב GST אינם מספקים פרוטוקול המפרט כל שלב של אחסון עיכוב אופטימלי, כגון המדידה של קבוע Michaelis-Menten (Km) עבור CDNB או אינדיקציה של ריכוז האנזימים המועסקים, פרמטרים קריטיים כדי להעריך את העוצמה העיכוב של תרכובת נבדק. לפיכך, עם פרוטוקול זה, אנו מתארים כל שלב של אסייג אנזים GST ספקטרופוטומטרי אופטימיזציה, כדי לסנן ספריות של מעכבים פוטנציאליים. אנו מסבירים את החישוב של ריכוז מעכב חצי מקסימלי (IC50) ואת הקבוע של עיכוב (Ki) – שני מאפיינים המשמשים כדי למדוד את העוצמה של מעכב אנזים. השיטה המתוארת ניתן ליישם באמצעות מאגר של GSTs שחולצו מתאי או GSTs אנושי רקומביננטי טהור, כל שם GST אלפא 1 (GSTA1), GST mu 1 (GSTM1) או GST pi 1 (GSTP1). עם זאת, אין אפשרות להחיל פרוטוקול זה על תטא GST 1 (GSTT1), מכיוון ש- CDNB אינו מקום עבור isoform זה. שיטה זו שימשה כדי לבדוק את העוצמה העיכוב של כורכומין באמצעות GSTs מכבד סוסים. כורכומין היא מולקולה המציגה תכונות אנטי סרטניות והראתה זיקה כלפי isoforms GST לאחר בתחזיות עגינה silico. הוכחנו כי כורכומין הוא מעכב GST תחרותי חזק, עם IC50 של 31.6 ± 3.6 μM ו Ki של 23.2 ± 3.2 μM. כורכומין יש פוטנציאל להיות משולב עם תרופות כימותרפיות אלקטרופיליות כדי לשפר את יעילותה.

Introduction

גלוטתיון Cytosolic S-transferase אנזימים (GSTs, EC 2.5.1.18) למזת את ההתייחדות של גלוטתיון (GSH) לתוך תרכובות אלקטרופיליות שונות, כגון סוכנים כימותרפיים, כדי לטהר ולחסל אותם בקלותמהגוף 1. שבעה isoforms של GST cytosolic זוהו אלפא, מו, פאי, סיגמה, אומגה, תטא, וזטה. GSTs באים לידי ביטוי בעיקר בכבד, אשכים, ריאות, ומערכת העיכול2. ISOform אלפא GST 1 (GSTA1) מבוטא מאוד hepatocytes. הגוף מבטא באופן הטרוגני תת סוגים אחרים, כולל GST pi 1 (GSTP1) בעיקר במוח, לב, וריאות, ו GST mu 1 (GSTM1) בכבד ואתיכים3. למרות שיש הומולוגיה רצף גבוה בין isoforms GST, כל תערוכות ספציפיות של ההתבססות והוא מעורב בחילוף חומרים של סמים וסרטן בדרכים שונות, על פי הביטוי ההפרנציאלישלה 4,5.

תרכובות אלקטרופיליות להיכנס לגוף אקסוגני או מיוצרים אנדוגני. חומרי הדברה, פרוסטגלנדינים, מסרטנים, ותרופות כימותרפיות הם חלק מה המצעים הפוטנציאליים לתגובות התייחדות גלוטתיון6. לדוגמה, כל תרכובת תגובתית לקויה אלקטרונים שנוצרה בתוך תא עשויה להפוך למלת אלקטרופילית. סוכני Alkylating כגון כלורמבוציל או melphalan מסולקים כמו התייחדות של GSH זירז על ידי GSTs, ורמות מוגברות של אנזימים אלה היו בקורלציה עם התנגדות לתרכובות אלה6,7.

תפקיד חשוב נוסף של GSTs cytosolic הוא ויסות הפעילות של קינאזות חלבון המופעלות על-ידי מיטוגן (MAPK) כגון MAPK8 (המכונה גם c-Jun N-מסוף קינאז, או JNK1) ו MAP3K5 (המכונה גם apoptosis אות ויסות קינאז 1, או ASK1)8. איזופורמים מסוימים בהקונפורמציה החד-מרית שלהם ייקשרו לחלבונים אלה ובכך יחסמו את מפל הפוספורילציה. בתנאים רגילים, isoform GSTP1 יבודד MAPK8 (מפעיל של חלבון c-Jun). שילוב c-Jun עם חלבון c-Fos יוצר את גורם שעתוק חלבון מפעיל 1 (AP-1), אשר אחראי על תמלול גנים פרו אפופטוטיים. בתאים לחוצים, המתחם שנוצר על ידי GSTP1 ו MAPK8 dissociates, c-Jun מופעל, ואת הגנים המובילים אפופטוזיס להתחיל לבוא לידיביטוי 9. ביטוי גדול יותר של isoform GST זה עשוי אפוא לחסום את המסלול, המוביל כדאיות תאים מוגברת, התפשטות תאית יותר, ורגישות תאית נמוכה יותר כימותרפיה. תרחישים דומים עלולים להתרחש עם פרלוגים של GSTP1, לדוגמה, GSTM1, המקיים אינטראקציה עם MAP3K510.

התפקידים שיחק על ידי GSTs בחילוף החומרים של התרופה ובבידוש של MAPKs הובילו להשערה כי ביטוי גדול יותר של GSTs עשוי להיות סימן של מנגנון התנגדות גידולית לטיפולכימותרפי 6,,11. לדוגמה, GSTP1 הוא בהגזמה בסרטן רבים ונוכחותו כבר בקורלציה עם פרוגנוזה עניים שכיחות מוגברת של נסיגה8. פולימורפיזם בגנים אלה הראה גם חשיפה דיפרנציאלית לסמים שיעורי הישרדות עבור חולים מציגים מחלות שונות, חיזוק הרעיון כי אנזימים אלה הם קריטיים למנגנונים של עמידות לתרופות. לדוגמה, אנשים עם הגנוטיפ NULL GSTM1 קשורים עם סיווג סמים נמוך יותרוהישרדות טובה יותר 12,13. ישנם מספר אמצעים פוטנציאליים של נגד דיכוי יתר זה, כגון השימוש של אנלוגיות GSH, prodrugs המופעלים על ידי התייחדות עם GSTs, או מעכבי GSTישיר 14,15.

כל השיטות האלה נמצאות כעת תחת חקירה, וכמה תרכובות החלו בניסויים קליניים לשימוש הפוטנציאלי שלהם בקרב חולים. עם זאת, למיטב ידיעתנו, אין תרכובות בשימוש כמעכבי GST בהגדרות קליניות15. אכן, חוסר ספציפיות עבור איזופורמים מסוימים או דלדול של GSH בתאים נורמליים, אשר עלול להוביל רעילות הנגרמת על ידי הצטברות של מיני חמצן תגובתי (ROS) במערכות איברים, הם רק חלק מהחסרונות אשר להפחית את הפוטנציאל של מעכבי GST14,15. הסיכון כי תרכובות אלה עשויים להפעיל השפעות פרמקודינמיות אחרות על הגוף גם מגבילים את השימוש שלהם. חומצה אתקרינית, למשל, הוא מעכב GST הנחקר ביותר בסביבות מעבדה, אבל בגלל שהוא משמש בעיקר כמשתן חזק, נכס זה מגביל את השימוש בו בשילוב עם תרופות אחרות בהגדרות קליניות. כורכומין הוא עוד תרכובת טבעית מוקרן בהצלחה כמעכב GST. מולקולה זו היא אתר פוליפנול שחולץ ממין כורכום לונגה של כורכום. זה הראה תוצאות מבטיחות כאפשרות טיפול אפשרי נגד סרטן על ידי גורם אפופטוזיס של סוגים שונים של קוויתא סרטניים 16,17. המתחם יכול לווסת מסלולים סלולריים מגוונים, כגון קינאז טירוסין18 או מסלול GST. מחקרים עם חלבונים טהורים הראו את העוצמה המעכבת שלה על GSTA1, GSTM1 ו GSTP119,20. עם זאת, תוצאות סותרות נצפו בתאים סרטניים, שם פעילות GST תאית גדולה נמדדה כאשר תאים טופלו עם כורכומין21. לכן, חשוב לחקור ריכוז מעכב חצי-מקסימלי (IC50) ואת הקבוע של עיכוב (Ki)של כל מעכב GST putative באמצעות פרוטוקול המתואר בבירור עם פקדים מתאימים לפני תכנון כל ניסויים תאיים נוספים.

סינון ובדיקה מעכבי GST חדשים פוטנציאליים הוא ולכן עניין קליני משמעותי, וכל תרכובת חדשה שנמצאה חייבת להיות בטוחה ויעילה לשימוש בשילוב עם תרופות אלקטרופיליות. התמקדות במחקר על מעכבי isoform ספציפי עשוי לאפשר עיכוב GST ברקמות הגידול המציגות דפוסים ספציפיים של ביטוי GST, ובכך לאפשר פיתוח של טיפול משולב יעיל. מציאת מעכבים עם מצבים דיפרנציאליים של עיכוב עשוי גם להיות עניין. לדוגמה, מעכב תחרותי המשתמש GSH כצע יכול לגרום דלדול שלה. הפחתה זו של ריכוז GSH בתאים הוצגה כדי לגרום סטרס חמצוני בנוירונים, המוביל אפופטוזיס. מצב נפוץ נוסף של עיכוב – עיכוב לא תחרותי – לא ניתן להפוך גם אם ההווה בריכוזים גבוהים.

קצב הפעילות האנזימטית מיוצג על-ידי הקבוע מיכאליס-אנטן (Km)והמהירות המרבית (Vmax),שניתן לקבוע על-ידי התוויית גרף מיכאליס-מאנטן, עם ריכוז ההתבססות כנגד מהירותהתגובה 23. Km הוא ריכוז של ההתבססות הנדרשת כדי לכבוש מחצית האתרים הפעילים אנזימטיים, כלומר Km גבוה מייצג פחות זיקה. Vmax מייצג את המהירות המרבית של התגובה, אליה הגיע כאשר כל האתרים הפעילים מאוכלסים על ידי הצוללת. Km שווה לחצי Vמקסימום. ישנם שלושה מצבי העכבה הנפוצים ביותר: תחרותי, לא תחרותי ולא תחרותי. במקרה של עיכוב תחרותי, המדכא נקשר לאתר הפעיל של האנזים ומתחרה עם הצוללת. לפיכך, Vmax לא משתנה לאחר תוספת של מעכב, אבל Km מגביר, כמו יותר בטוב נדרש כדי להתמודד עם העיכוב. עיכוב לא תחרותי מתרחש רק כאשר העיטורי יוצר תסביך עם האנזים. במקרה זה, כמו רמת העיכוב תלוי בריכוז המצע והאנזימים, Vמקסימום ו Km להקטין כאשר מעכב מתווסף לתגובה. המצב האחרון של עיכוב הוא לא תחרותי והוא שילוב של שני דפוסי עכבה אחרים. המדכא יכול להיקשר לאתר הפעיל של האנזים אם האנזים קשור למצוע שלו או לא. כאן Vמקסימום פוחת לאחר תוספת של המדכא, אבל Km לא לשנות24.

אסייג ספקטרופוטומטרי שמדד את פעילות GST פותח לראשונה על ידי Habig et al. בשנת 1974 באמצעות 1-כלורו-2,4-dinitrobenzene (CDNB) כמצע לתגובה22. התייחדות בין GSH ו- CDNB יוצרת GS-DNB, המציגה ספיגת אור מקסימלית באורך הגל של 340 מילי-מ”ר, הניתנת לצריבה עם ספקטרופוטומטר. רוב הטכניקה המוסברת להלן נגזרת Habig et al., כולל מידע על ההגדרות הטובות ביותר ונקודות אופטימיזציה חשובות עבור אחסון מעכב. הטכניקה יכולה להיות מיושמת על הקרנת מעכבי GST פוטנציאליים, אם נבחר על ידי בחירת תרופות רציונליות באמצעות תחזיות חישוביות או על ידי סקירת ספרות. כיצד להתאים את הפרוטוקול חלבוני GST מסונתז חדש או isoforms ספציפיים נדון גם. לדוגמה, בדיקת העוצמה המעכבת של isoforms GST המציגים פולימורפיזם רלוונטי קלינית או של פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (SNPs) יכול להיות שימושים פוטנציאליים עבור פרוטוקול זה, מיקוד GSTs ספציפי למטופל.

פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה, אפשרית ויעילה להקרנה של מעכבי GST פוטנציאליים במבחנה לפני כל מחקרים פונקציונליים אחרים. השלבים הדרושים כדי להעריך את המאפיינים הנמדדים הנפוצים ביותר של מעכב אנזימטי מתוארים: הריכוז מעכב 50 (IC50) כי הוא ריכוז של מעכב הנדרש כדי להקטין את הפעילות האנזימטית על ידי מחצית; ואת הקבוע של עיכוב (Ki)המייצג את קבוע שיווי המשקל של הדיסוציאציה בין מעכב האנזים, האופייני של הזיקה בין שתי מולקולות אלה. שני ערכים אלה נמדדים על-ידי רגרסיה לא ליניארית ושימוש במשוואות ספציפיות לכל מצב של עיכוב, בהתאמה. אנו גם מדגימים את ההערכה של דפוס זה של עיכוב, באמצעות מזימות Michaelis-Menten כדי לקבוע את השינוי של Vמקס ו Km לאחר תוספת שלמעכב 23,,25,,26.

Protocol

1. הכנת פתרון האנזים GST הערה: ההליך להכנת פתרון האנזים תלוי אם יחידות הפעילות האנזימטית ידועות לפני ההתסה. יחידה אנזימטית אחת היא כמות האנזים הדרושה כדי לסנתז 1 μmol של מוצר לדקה. פעילות אנזימטית מיוצגת ביחידה/מ”ל או μmol/min/mL ותלויה באופן דילול הפתרון האנזימטי. פעילות אנזימטית ספציפית מיוצגת יחידה / מ ג או μmol / מינימום / מ ג ותלוי אך ורק על טוהר הפתרון. שני מאפיינים אלה נקבעים להלן. אם היחידה האנזימטית של isoform GST מבודד אינו ידוע, יש להעריך כדי להתאים את הריכוזים האנזימטיים עבור כל תגובה ולספק תוצאות לשחזור. אם היחידה האנזימטית של GST המשמש ב- assay ידוע: הכן פתרון מלאי טרי של אנזים GST ב 0.1 U/mL במים ולאחר מכן להמשיך עם שלב 2.הערה: ניתן לאחסן פתרון זה ב- -20 °C ב aliquots במשך מספר חודשים או ב–80 °C לתקופות ארוכות יותר, אך יש להימנע ממחזור ההקפאה/הפשרה. אם היחידה האנזימטית של GST בשימוש ב- assay אינה ידועה: לכמת את ריכוז החלבון של תמיסת האנזימים באמצעות חומצה bicinchoninic (BCA) חלבון סיסא, או כל ערכה אחרת. לדלל את תמיסת החלבון לריכוז חלבון סופי של 0.02 מ”ג/מ”ל. להוסיף 20 μL של פתרון האנזים, 20 μL של GSH 25 mM (משקל מולקולרי: 307.32 g/mol), ו 150 μL של תמיסת מלח פוספט של Dulbecco אגירה (DPBS) לצלחת 96-באר. עבור ריק, להוסיף 20 μL של מים במקום פתרון אנזים. להוסיף 10 μL של CDNB 50 mM (משקל מולקולרי: 202.55 g/mol)מצע לכל באר. על קורא מיקרופלאטומטרי ספקטרופוטומטרי, הגדר את הפרמטרים לקריאת הבארים ב- 340 00 00 00 00:00:00,000 .ב- 340 00 00:00:00,000—— מומלץ למדוד את הספיגה כל דקה במשך 10 דקות. הכנס את הלוח לקורא המיקרו-פלטות והתחיל לקרוא בהתאם להגדרות של שלב 1.2.5. חשב את השינוי בספיגה לדקה עבור הדגימות האנזימטיות והריק.הערה: ודא שהתגובה ליניארית על-ידי התוויית ספיגה בציר y ודקות בציר ה- x. אם התגובה אינה ליניארית ומגיעה לרמה, פירוש הדבר שכל הבצע משמש והתגובה מהירה מדי. לכן, להפחית את כמות האנזים שנוסף לבאר על ידי דילול פתרון המניות על ידי שניים. תקן את קריאות הספיגה של דגימות הבדיקה. עם משוואה 1, המייצגת את חוק באר-למברט, חשב את ריכוז ה-GS-DNB שנוצר (ב-μM) על ידי התגובה בכל דקה.משוואה 1:כאשר C הוא הריכוז של המצע ב- μM,340/דקה הוא שינוי הספיגה לדקה, כפי שנמדד בשלב 1.2.7, ε הוא מקדם הכחדה טוחנת עבור CDNB להצייד ב 340 צפון צפון (0.0096 μM-1*ס”מ-1),ואני אורך נתיב האור בבאר (בס”מ). עבור צלחת 96-באר מלא 200 μL של פתרון אנזימטי, אורך הנתיב הוא סביב 0.55 ס”מ. ערך זה עשוי להשתנות בהתאם למודל הלוחות ויש לאמת אותו עם היצרן. כדי לקבוע את כמות המוצר הנוכחי בבאר אחת ב- μmol/min, הכפל את התוצאות שנמצאו באמצעות משוואה 1 לפי נפח הפתרון, 2 x 10-4 L. לנרמל את הפעילות לכל כמות של חלבון בשימוש על ידי חלוקת התוצאות של שלב 1.2.9 על ידי 4 x 10-4 מ”ג. התוצאה היא פעילות אנזימטית ספציפית ביחידה/ מ”ג או μmol / מינימום / מ ג.הערה: אם דילול השתנה בשלב 1.2.6, עקב תגובה לא ליניארית, התאם את כמות החלבון בהתאם. כדי למצוא את הפעילות האנזימטית, להתאים את התוצאות לריכוז החלבון במ”ג/מ”ל על ידי הכפלת הפעילות האנזימטית הספציפית שנמצאה בשלב 1.2.10 על ידי 0.002 מ”ג/מ”ל. זה ייתן את הפעילות האנזימטית ביחידה / מ”ל או μmol / מינימום / מ”ל.הערה: בניגוד לפעילות האנזימטית, מדד זה לא ישתנה בהתאם לדלול תמיסת החלבון. אותו פתק כמו שלב 1.2.10 אבל לריכוז החלבון. הכן פתרון מלאי של אנזים GST ב 0.1 יחידה / מ”ל במים ולאחר מכן להמשיך עם שלב 2.הערה: ניתן לאחסן פתרון זה ב- -20 °C ב aliquots במשך מספר חודשים או ב–80 °C לתקופות ארוכות יותר, אך יש להימנע ממחזור ההקפאה/הפשרה. שליטה על הפעילות האנזימטית מומלצת אם הניסויים נערכים במהלך פרק זמן ממושך כמו השפלה של תמיסת החלבון עלולה להתרחש. 2. מדידה של הקבוע מיכאליס-מאנטן של isoform GST עבור CDNB הערה: ההליך מוסבר עבור פגם CDNB אך ניתן להחילו על כל פגם אחר, כגון GSH. כל ריכוז של CDNB צריך ריק משלו, כמו הספיגה ב 340 נמיר יגדל על פי ריכוז CDNB. להכין שישה ריכוזים שונים של CDNB, החל 10 mM כדי 100 mM, אתנול 95% (v / v). להכין את פתרון assay, עם 10 μL של CDNB, 20 μL של אנזים GST, 20 μL של GSH 25 mM, ו 150 μL DPBS. עבור ריק, במקום פתרון CDNB, להוסיף רק 10 μL של אתנול 95%. להכין ריק עבור כל ריכוז CDNB, עם 10 μL של CDNB, 20 μL של מים, 20 μL של GSH 25 mM, ו 150 μL DPBS. הקלט את הספיגה במהירות של 340 00 00 00 00 00:00:00,000 ————————————– תקן את הספיגה על-ידי חיסור התוצאות מהריק מזה של בארות הבדיקה האחרות הנכונות. בהתאם לערכים הנמדדים, חשב את מהירות התגובה באמצעות משוואה 2.משוואה 2:כאשר A340/min הוא השינוי הניסיוני בספיגה לדקה, Vהכולל (נפח כולל) שווה 0.2 מ”ל,אנזים V (נפח של אנזים) הוא 0.02 מ”ל, ו- εGS-DNB הוא מקדם הכחדה טוחנת של GS-DNB להציף ב 340 נה”מ (9.6 mM-1*cm-1). בבאר 200 μL של לוח 96-באר, אורך הנתיב הוא 0.55 ס”מ (בהתאם לסוג הלוח) ומקדם הכחדה שווה 5.3 mM-1. המהירות יכולה להיות מיוצגת על ידי μmol / mL / min או mM / דקות. התווה את גרף מיכאליס-אנטן במהירות (על ציר ה- y) כנגד ריכוז ההשתלה (על ציר ה-x). הגדר את המהירות המרבית (Vmax)של התגובה ואת הקבוע Michaelis-Menten (Km) (כלומר, ריכוז ההשתוב בחצי Vמקסימום).הערה: באמצעות תוכנה כגון פריזמה GraphPad, עקומת קינטיקה אנזים ניתן לתקין באמצעות רגרסיה לא ליניארית לחישוב של הפרמטרים קינטיקה אנזימים מיכאליס-Menten, כגון Vmax ו Km. הכן פתרון מניית CDNB פי 20 מה-Km המחושב באתנול 95% (v/v). 3. ספיגה של מעכב GST פוטנציאלי הערה: שלב זה מבוצע כדי לחקור אם מעכב GST פוטנציאלי בשימוש בתגובה מייצר מטבוליט שמגביר את הספיגה באורך הגל הנמדד. אם זה עושה, את כמות מעכב בשימוש תהיה השפעה על התוצאות ריק ספציפי צריך להיות מוכן לכל ריכוז. לדלל את המדכא לריכוזים הנדרשים.הערה: הכן שלושה דילולים שונים, רצוי הריכוזים הנמוכים ביותר, האמצעיים והגבוהים ביותר שנבדקו במהלך ההסכם. ריכוז DMSO המרבי בבאר צריך להיות שווה או פחות מ 1% (v/v). בדקנו את ההשפעה של ריכוז DMSO על ההסתה במעבדה שלנו, ו-1% לא שינו באופן משמעותי את פעילות GST. בצלחת 96-באר, להוסיף 2 μL של מעכב GST פוטנציאלי, 20 μL של GSH 25 mM, ו 168 μL של DPBS. השתמש בפקד המתאים, ללא מעכב, על ידי הוספת אמצעי אחסון שווים של הממס המשמש עבור דגימות מעכב. להדגר את התגובה במשך 10 דקות, כדי להתחיל את התגובה האנזימטית.הערה: ניתן למטב שלב זה, על-ידי בדיקת זמני דגירה שונים, כאשר המטרות התאומות של תחילת התגובה תוך הימנעות מדלדול מוחלט של הצוללת. להוסיף 10 μL של CDNB לכל באר כדי להשיג ריכוז סופי ב Km נמצא בשלב 2. לנער את הצלחת לכמה שניות. הקלט את הספיגה במהירות של 340 00 00 00 00 00:00:00,000 ————————————– חשב את השינוי בספיגה לדקה. ודא את השינוי בספיגה בהשוואה לתגובה הריקה והתגובה השלילית ללא מעכב. אם יש שינוי משמעותי, להשתמש ריק עבור כל ריכוז מעכב על מנת להתאים את התוצאות.הערה: תוצאה זו מצביעה על כך שמרכיבי התגובה, ללא אנזים GST, מגיבים באופן ספונטני ומייצרים מטבוליט שמגביר את הספיגה ב-340 00 00 00 00:00.00,000.00,000.00,000.00,000.00,000.00,000-מ”ר. כדי לתקן ספיגה נוספת זו, יש למדוד ריק ספציפי עבור כל ריכוז. אם אין שינוי משמעותי בספיגה, השתמש ריק כללי, המכיל רק את הממס המשמש לדלול מעכב GST, עבור כל הריכוזים. 4. עיכוב ים של GST והערכת IC50 הכן תשעה ריכוזים של מעכב GST פוטנציאלי.הערה: ניתן להתאים את הריכוזים בהתאם לתוצאות. המטרה היא להגדיר את הרמה התחתונה והלמעלה של עקומת הרגרסיה הלא ליניארית. עיין בסעיף הדיון לקבלת פרטים נוספים אודות שלב זה. הכן את פתרון ה-assay על-ידי דילול 20 μL של פתרון GSH ב- 25 mM עם 148 μL של DPBS. התאם את עוצמת הקול בהתאם למספר בארות המשמשות בהסכם. בצלחת ברורה 96-באר, להכין את התגובה אנזימטית כרך סופי של 190 μL. מומלץ להשתמש פיפטה רב ערוצית עבור שלבים אלה. עבור בארות הבדיקה, להוסיף 20 μL של פתרון האנזים, 2 μL של פתרון מעכב GST פוטנציאלי 168 μL של פתרון assay. עבור הפקד, להוסיף 20 μL של פתרון האנזים, 2 μL של דילול המשמש מעכב GST ו 168 μL של פתרון ה-assay. עבור בארות ריקות, להוסיף 20 μL של מים, 2 μL של מעכב GST פוטנציאלי ו 168 μL של פתרון ה-assay.הערה: אם מעכב GST סופג את אורך הגל 340 ננ”מ, אז ריק ספציפי צריך להיות מוכן עבור כל ריכוז נבדק. הוסף 10 μL של פתרון CDNB ב 20x Km לכל באר, כולל ריק. מומלץ להשתמש פיפטה רב ערוצית עבור שלב זה. לנער את הצלחת לכמה שניות. מדוד את הספיגה במהירות של 340 00 00 00 00 00:00:00,000 ————————————- תקן את הספיגה על-ידי חיסור התוצאות מהבדיקה. לנרמל את התוצאות על ידי חלוקת הערכים שהתקבלו באמצעות פתרון מעכב GST על ידי הספיגה של הפקד לדקה ללא מעכב. התווה את גרפים רגרסיה לא ליניאריים של הריכוז הלוגאריתי (ציר x) של המדכא נגד פעילות GST (ציר y), ובכך לקבוע את IC50.הערה: מנסרה GraphPad מחשבת את IC50 מתוך חלקות רגרסיה לא ליניארית על-ידי חיזוי הריכוז שיצג 50% מהפעילות האנזימטית בפקד. התחזית מבוססת על הרמה התחתונה והלמעלה, כמו גם על עקומת המדרון שנוצר על ידי גרף סיגמואיד. 5. הערכת Kiוסוג העכבה הכן ארבעה ריכוזי CDNB שונים: שלושה גבוהים יותר ואחד שווה Km נמצא בעבר. להכין שלושה ריכוזי מעכב GST שונים, שווה או מתחת IC50 נמצא בעבר. בצע את תוואי העיכוב כמתואר בשלבים 4.2 עד 4.7. חשב את מהירות התגובות באמצעות משוואה 2. התווה את הגרפים מיכאליס-מאנטן עבור כל ריכוז מעכב ולחשב את מקסימום Vו Km של כל תגובה. על פי השינויים Vמקסימום ו Km בעת שימוש בריכוזים שונים, להעריך את מצב מעכב GST.הערה: שלב זה מוסבר בפירוט רב יותר במקטעי התוצאות והדיון. בהתבסס על מצב העיכוב, לחשב את Ki.הערה: ב מנסרה GraphPad, משוואות שונות ישמשו לחישוב Ki בהתאם לאופי של העיכוב. המשוואות המשמשות מבוססות על Km ו-V max שנצפו לאחר תוספת של המדכא ובהשוואה ל-Km ו-V max שלהבקרה.

Representative Results

מיכאליס-אנטן קבוע (Km) של CDNB עם GST מכבד סוסיםכורכומין הוא תרכובת טבעית בטוחה גם לאחר בליע במינוניםגבוהים יותר 27 שהראה תכונות נגד סרטן16. העוצמה המעכבת של מולקולה זו הוכח על GSTs רקומביננטיאנושי 19,,20. באמצעות הפרוטוקול המתואר, הערכנו את ההשפעה של כורכומין על פעילות GST באמצעות מאגר של isoforms GST מכבד סוסים. לדברי הספק, הפעילות הספציפית של תערובת זו של חלבונים היא 25 U/mg. פתרון מלאי של 0.1 U/mL הוכן על ידי המסת אבקת lyophilized בכמות המתאימה של מים. חומצה אתקרינית שימש במקביל כשליטה חיובית כמו תרכובת זו היא מעכב GST הנפוץ ביותר במחקרים. שלבים בהגדרת תוואי פעילות GST ובדיקה של מעכבים מתואר איור 1. Km יש להגדיר עבור כל תגובה אנזים שקע כי באמצעות ריכוז הצוללת שווה ערך Km יבטיח שום הטיה לגבי הקביעה של מצב העיכוב28. שישה ריכוזים שונים של CDNB, החל מ 0.5 mM כדי 5 mM, נבדקו כדי למדוד פרמטר זה, באמצעות ריכוז קבוע של 2.5 mM GSH. הכרך האחרון של התגובה היה 200 μL, בצלחת 96-באר. ריק ספציפי שימש עבור כל ניסוי, באמצעות אותו ריכוז של CDNB כמו הבדיקה גם כי התייחדות ספונטנית של CDNB ו GSH עלולה להתרחש ואולי להגביר את הספיגה. ריכוז אנזים סופי של 0.01 יחידה/מ”ל שימש לכל התגובות, על ידי הוספת 20 μL של פתרון המניות לתערובת ה-assay. ספיגה של 340 00 00 00 00:00 נרשמה בכל דקה במשך 10 דקות. המהירות (ב- mM/min) של התגובה חושבה באמצעות משוואה 2. גרף מיכאליס-מאנטן התווה את ריכוז המצע (mM) כנגד המהירות (איור2), ו-Km של התגובה חושב. הניסוי חזר על עצמו עד שלפחות שלוש קבוצות של נתונים הראו תוצאות דומות. Km של CDNB עם GST מכבד סוסים נמדד כ 0.26 ± 0.08 mM. ריכוז של 0.2 mM של CDNB שימש עבור כל תסה מעכבת באמצעות קבוצה זו של GSTs. שום היווצרות ספונטנית של מטבוליט שנקלט ב 340 nm נמדד במהלך ניסויים באמצעות כורכומין דגירה לבד עם GSH ו CDNB. אותו ריק שימש לכל ריכוז מעכב בכל ניסוי. העוצמה המעכבת של כורכומין על GSTsהעוצמה המעכבת של כורכומין נחזה באמצעות סימולציה עגינה סיליקו עם תוכנה (למשל, AutoDock Vina גרסה 1.1.2). 29 אנרגיית האיגוד החופשי בין isoforms GST שונים (כליאה GSTA1, GSTM1 ו GSTP1) כורכומין היה צפוי (הנתונים לא הוצגו). לאחר מכן, הקבוע של עיכוב Kחושב באמצעות משוואה 3. משוואה 3:כאשר ∆G היא אנרגיית הכריכה החופשית שנמצאה באמצעות ניתוח סיליקו, R הוא קבוע הגז של 1.987 cal*K-1*mol-1, ו- T היא הטמפרטורה במהלך הניסוי, במקרה זה בקלווין (298 K). בהתבסס על תוצאות האנרגיה מחייב חינם שהוחזרו על ידי Vina AutoDock, כורכומין הוא מעכב GST חזק של GSTA1 אנושי, GSTM1 ו GSTP1, עם ערכי Ki של 78.1 μM, 78.1 μM ו 27.4 μM בהתאמה. ההתעכבות הראשונה נערכו באמצעות הערכות חישוביות אלה Ki, והריכוזים הותאמו בהתאם לתוצאות, במידת הצורך. ראשית, ההערכה היא שה-IC50 הוערך. מאפיין זה הוא ריכוז של מעכב המפחית את שיעור התגובה של אנזים על ידי 50%. לכן הוא תלוי בריכוז האנזימים30. תשעה ריכוזים סופיים של המדכא הוכנו, החל 0.39 μM כדי 100 μM עם כל ריכוז כפול מזה של הקודם. פתרון ה-assay היה מורכב 20 μL של GSH 2.5 mM, 20 μL של GST מכבד סוסים ב 0.01 U /mL הסופי, 2 μL של פתרון כורכומין, ו 148 μL של PBS. הפקד היה מורכב מאותו פתרון עם דילול המשמש כורכומין. תערובת זו הייתה דגירה במשך 15 דקות כדי להתחיל את תמיסת האנזימים ולהימנע השפלה של כורכומין בתמיסת ההסתה, כמו תרכובת זו אינה יציבה בפתרונות מאגר31. הבא, 10 μL של פתרון CDNB ב 4 mM נוספה לכל באר, עבור ריכוז סופי של 0.2 mM CDNB. ספיגה של 340 נה”מ נרשמה בכל דקה במשך 10 דקות, כדי לחשב שינויים בספיגה לדקה. כדי לחשב את IC50, כל מדגם מדגרה עם כורכומין היה מנורמל לבקרה, כדי לתת את אחוז הפעילות. תוצאות אלה נותחו באמצעות תוכנת התוויית על ידי חישוב הרגרסיה הלא ליניארית של הריכוז הלוגאריתי של מעכב לעומת העיכוב. IC50 נמצא כורכומין על GST מכבד סוסים היה 31.6 ± 3.6 μM(איור 3A). אותו ניסוי נערך במקביל באמצעות חומצה אתקרינית כשליטה חיובית, עם ריכוזים הנעים בין 0.39 ל-100 μM, כמו עם כורכומין. IC50 נמצא 6.6 200 ± 1.1 μM (איור 3B). השלב הבא היה להעריך את מצב העיכוב של כורכומין על העברות אלה. ארבעה ריכוזים שונים של כורכומין נבדקו: 0, 7.5, 15, ו 30 μM, יחד עם ארבעה ריכוזים שונים של CDNB: 0.2, 0.4, 1, ו 1.5 mM. הפרוטוקול היה זהה לניסוי הקודם. המהירות של כל תנאי חושבה באמצעות משוואה 2. עקומה היה התווה עבור כל ריכוז מעכב, עם המהירות (ב μM / דקות) נגד ריכוז המצע (mM)(איור 3C). Vמקסימום ו Km נקבעו בהתבסס על כל עלילה עם פריזמה GraphPad. מצב העכבה של המדכא הפוטנציאלי הוערך בהתאם לשינויים בשני הפרמטרים הללו ולמצבם השונה של ה-Assays. 24 כמו Vמקסימום לא לשנות באופן משמעותי בין התנאים אבל Km גדל עם ריכוזי מעכב שונים, עיכוב כורכומין של GSTs הוא תחרותי. דפוס זה של עיכוב מתרחש כאשר מעכב מתחרה עם הצוללת עבור האתר הפעיל של האנזים. כדי למדוד את Ki של מעכב תחרותי, GraphPad משתמש במשוואה 4 ומשוואה 5 כפי שתואר על ידי קופלנד ואח ’32.משוואה 4:משוואה 5:כאשר Km obs הוא הקבוע מיכאליס-אנטן שנצפה, Km הוא הקבוע מיכאליס-מאנטן של השליטה,[אני]הוא ריכוז מעכב, Ki הוא הקבוע של עיכוב, Y הוא המהירות, ו X הוא ריכוז המצוע. החישובים מבוססים על אותם ניסויים כמו ההערכה של מצב העיכוב. Kאני העריך לעיכוב של כורכומין של GST מכבד סוסים היה 23.2 ± 3.2 μM. איור 1: תרשים זרימה המתאר את השלבים של ה-GST אנזימטי ומעכבת. פרטים אודות ההליך מוצגים במקטע הפרוטוקול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 2: העלילה מיכאליס-מאנטן של פעילות אנזימים GST. ריכוז מוגבר של המצע CDNB שימשו עם ריכוז קבוע של GSH (2.5 mM) כדי לקבוע את פעילות GST ממאגר של GST מכבד סוסים. ערך K m עבור CDNB נקבע כ- 0.26 ± 0.08 mM בהתאם לעקומת הגרף. כל נקודת נתונים על העלילה מייצגת את ממוצע ארבע ריצות ניסיוניות שונות עם SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3: השפעת כורכומין וחומצה אתקרינית על פעילות אנזימים GST. (א-ב) מה אתה עושה? תוספת של הגדלת ריכוזים של כורכומין(A)או חומצה אתקרינית שליטה חיובית (B), תוך שמירה על אותו GST (0.01 U/mL), GSH (2.5 mM) ו CDNB (0.2 mM) ריכוזים סופיים שימשו לחישוב IC50 של שתי תרכובות GST מכבד סוסים עם רגרסיה לא ליניארית. IC50 נקבע כ- 31.6 ± 3.6 μM עבור כורכומין ו- 6.6 ± 1.1 μM עבור חומצה אתקרינית. (ג)מיכאליס-Menten עלילה של ריכוזים שונים של כורכומין, נבדק נגד ריכוזים שונים של מצוע CDNB המציין מצב תחרותי של עיכוב. ללא מעכב, Vמקסימום ו Km נמדדו כמו 132.7 ± 4.6 μM ו 0.5 ± 0.08 μM, בהתאמה. עם 30 μM של כורכומין, Vמקסימום ו Km היו 130.4 ± 13.1 μM ו 1.08 ± 0.39 μM. נקודות נתונים בכל הגרפים(A-C)מייצגים את האמצעים של שלוש ריצות ניסיוניות שונות עם SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

אנו מספקים פרוטוקול המתאר כל שלב של אסייג אנזים GST ספקטרופוטומטרי, כדי לסנן מעכבי putative (איור 1, טבלה 1) ולכימת את העוצמה המעכבת שלהם. כמו כן הדגשנו את הקריטריונים הקריטיים ביותר שיש לשקול עבור אנזימים מדויקים המספקים תוצאות לשחזור. היתרונות העיקריים של הפרוטוקול המתואר על פני שיטות צבע אחרות או ספקטרומטריה מסה הוא כי פרוטוקול זה הוא מהיר וקל לביצוע ולספק מדידות כמותיות של פעילות GST, כמו גם את העוצמה העיכוב של מולקולות מוקרנות.

אנו מציגים את הדרך של חישוב שני הפרמטרים החשובים ביותר מיכאליס-אנטן של מעכב אנזים: IC50 ו Ki. מעכב חזק יפעיל את Ki ו IC50 הנמוך ביותר האפשרי, המציין כי הזיקה בין מעכב האנזים הוא גבוה30. כמו IC50 תלוי ריכוז אנזיםותנאי אסה 33, ייתכן שיהיה קשה להשתמש בערך זה כדי להשוות מעכבים מניסויים שונים או הושג באמצעות תנאי אסאיאחרים 34. באמצעות הקבוע של עיכוב Kאני הוא אינדיקטור טוב יותר של העוצמה המעכבת של תרכובות פוטנציאליות. Kאני יכול לשמש כדי להשוות שני מעכבים עם מצבים שונים של עיכוב, כפי שהוא מסתמך אך ורק על הזיקה בין מעכב האנזים. עם זאת, כדי לקבל מושג ברור של אופי העיכוב אחד חייב לקבוע את שני הפרמטרים של המדכא30. מדדנו IC50 של כורכומין ו Ki כמו 31.6 ± 3.6 μM ו 23.2 ± 3.2 μM, בהתאמה, המציין כי מתחם זה הוא מעכב GST חזק. תוצאות אלה אישרו את התחזיות silico, כי העריך את ערכי Ki בין 27.4 כדי 78.1 μM עבור isoforms GST אנושי שונים כורכומין.

פעילות אנזימטית או קצב תגובה וכמות אנזים
כאמור, IC50 תלוי בריכוז האנזימים, וביצוע ניסוי ברמה לא ידועה של פעילות אנזימטית עלול להוביל למסקנותשגויות 33. כדי לשלוט על גורמים אחרים, אשר עשוי להפחית פעילות מעכבת, יש לשקול גם למדוד פעילות אנזימטית עבור כל קבוצה חדשה של GSTs. לדוגמה, השפלה של אצווה אנזימטית, הנגרמת על ידי מחזורי הקפאה/הפשרה רבים מדי, עשויה להקטין את הפעילות ובכך להוביל ל-IC50 נמוך יותר גם אם הניסוי נוהל באותם תנאים. במילים אחרות, שימוש 0.01 יחידות של אנזים לא ייתן את אותן תוצאות כמו באמצעות יחידה אחת. שימוש באנזימים רבים מדי עלול להוביל לדלדול מהיר של הצוללת ולתגובה לא תהיה צורה ליניארית. פרמטר זה עלול להוביל אפוא לתוצאה לא מדויקת, מכיוון שלא ניתן יהיה לראות שינוי בספיגה לאחר זמן דגירה ארוך.

ערךK מ’
כדי להבטיח את התנאים הטובים ביותר להערכת סוג העכבה המוצגת על ידי מעכב, ריכוז המצוע חייב להיות שווה או מתחת לקבוע מיכאליס-מאנטן (Km). Km מיוצג על ידי ריכוז של העשמי הנדרש לכבוש מחצית מהאתרים הפעילים על האנזים28. לדוגמה, ריכוז טוב יותר יכול לנטרל מעכב תחרותי והערכת סוג זה של עיכוב יהיה קשה בסביבה כזו. לכן, אחד השלבים המכריעים ב מתודולוגיה זו היא קביעת Km של האנזים עבור הצוללת שנבחרה (כאן CDNB). במחקרים מסוימים, ערך זה לא נקבע וזה יכול להוביל למסקנות כוזבות על דפוס העכבה שנגרם על ידי המדכא, ואם מצב העיכוב שגוי, Kאני יחושב באופן שגוי כמו המשוואה מסתמכת על דפוסשל עיכוב 26,28. אם isoform GST שונה נבדק, הערכה חדשה של ערך Km היא חובה, כמו ערך זה הוא ייחודי עבור זוג אנזים ליגנד. כפי שהשתמשנו בריכוז של CDNB מעט נמוך יותר Km (0.2 mM), כי אנו הגדירו כמו 0.26 ± 0.08 mM, המצב התחרותי הצפוי של עיכוב כורכומין על GST נקבע במדויק.

IC50 (IC50)
השגת עקומת סיגמואידית טובה שבה ניתן להעריך את IC50 דורשת מציאת הרמה התחתונה והן ברמה העליונה. הרמה התחתונה מייצגת את הריכוזים של מעכב המספקים את הפעילות המעכבת המרבית. במקרים מסוימים, תרכובת לא יכול לעכב את האנזים באופן מלא, אפילו בריכוזים גבוהים, בגלל בעיות טכניות כגון מסיסות. עם זאת, כלים כמו פריזמה GraphPad יכול להתאים את הרמה התחתונה די מדויק. הרמה העליונה מורכבת מריכוזים של המדכא, שאינם מספיקים כדי לעכב את האנזים, ולכן הפעילות היא מקסימלית. שתי מישור אלה חיוניות לקביעת IC50, כמו גם ריכוזים בין לבין, על מנת למצוא את השיפוע של העקומה – אז IC50 ניתן לגזור מצורת עקומת סיגמואיד35. כורכומין הוא מסיס בצורה גרועה במים, ולכן הריכוז המרבי המשמש בהסכם זה מוגבל, כדי למנוע משקעים בתמיסת ההסתה. לכן, פתרונות מרוכזים פחות, אשר אינו מעכב באופן מלא את פעילות GST, שימשו. זה העלה סוגיות לקביעת הרמה התחתונה. כדי להתמודד עם בעיה זו, חזינו ערכים תחתונים בהתבסס על גרף רגרסיה לא ליניארי, אשר סיפק IC50 של 31.6 ± 3.6 μM עבור כורכומין (איור 3A). עבור חומצה אתקרינית, לא היה צורך לחזות את הערכים עבור הרמה התחתונה כמו תרכובת זו היא מסיסה בתמיסת ההסתה וIC50 נמדד ב 6.6 ± 1.1 μM.

ניתן להחיל שיטה זו על isoforms GST המבוטא ביותר באדם, כלים GSTA1, GSTM1 או GSTP1. עם זאת, פרוטוקול זה אינו מתאים לכמת את הפעילות של isoform GSTT1, כמו CDNB אינו שקוע עבור סוג משנה זה. הציון כולל 36, 37 בינתיים, ניתן לשנות במקצת את הפרוטוקול כדי להתמודד עם בעיה זו. לדוגמה , שימוש 1,2-אפוקסי-3-(4′-nitrophenoxy)פרופן (ENPP) כמצע עבור GSTT1 ומדד את כמות ההתייחדות ב 360nm במקום 340nm. 37 (37)

שלבי פרוטוקול יכול להיות מותאם ומיושם כדי לבדוק פעילות GST ובדיקות מעכב בניסויים תרבות התא. מדידה של פעילות GST על תאים שטופלו עם ובלי מעכב GST יציין אם תרכובת זו יכולה לשמש בסביבה ניסיונית כזו. זה מעניין במיוחד כאשר המדכא הוא ליפופילי. למשל, הגנו כי כורכומין הוא מעכב GST חזק באמצעות פרוטוקול זה. אף על פי כן, היישום שלה ללימודי סלולר עשוי להיות מוגבל, כמו המולקולה היא מסיסה בצורה גרועה במים ומשפיל במהירות בינוני. 31 התבוללות נוספת של פרוטוקול זה אפשרית לגבי ספציפיות אי-isoform של ה-CDNB של הצוללת. שימוש בפרוטוקול זה במחקרי תאים ייתן מידע רק על פעילות GST הכוללת, אך לא על הפעילות של סוג משנה GST מדויק. הוספת isoform ספציפית לשקוע ו/או באמצעות isoform GST רקומביננטי ספציפי יאפשר לבדוק מעכבי GST ספציפיים isoform.

לסיכום, אנו מתארים הליך מלא כדי לבדוק מעכבי GST שיש להם פוטנציאל לשמש בשילוב עם כימותרפיה אלקטרופילית. הדגשנו את השלבים הקריטיים של אנזים GST ועיכוב assay, כדי לבדוק מולקולה מעניינת פוטנציאלית ולקבוע את היעילות שלהם כמעכב עם ערכים כמותיים, IC50 ו Ki. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל תרכובת putative ומבוצעת על איזופורמים GST האנושי המבוטא ביותר (GSTA1, GSTM1 ו GSTP1), או מותאם מעט לבצע מחקרי תרבות תאים עם מעכבי GST או למדוד את הפעילות של איזופורם GST מעניין אחר של בחירה.

ריאגנטים שם ריכוז בתמיסת ההסתה אחרים
המצע CDNB (CDNB) נמדד Km (mM) מדולל ב-95% אתנול. ריכוז האתנול הסופי צריך להיות ≤ 5% (v/v)
התקהלות של התקהלות ג’י.ש.ש. 2.5 מיליון מ’ מדולל במים.
הריכוז חייב לרוויה את הפתרון.
מאגר Pbs – pH = 7.1
אנזים מאגר של isoforms GST או isoform טהור 0.01 יחידה/מ”ל, נקבע באופן ניסיוני. מדולל במים.
מעכב GST תרכובת פוטנציאלית של בחירה IC50: 3 ריכוזים שמעכבים באופן מקסימלי, 3 שמעכבים באופן מינימלי, ו-3 באמצע. מדולל DMSO ולאחר מכן במים, יש ריכוז סופי של DMSO ≤ 1% (v / v)
Ki:3 ריכוזים סביב IC50.
פרמטרים
טמפרטורת החדר (25°C)
pH = 7.1
DMSO ≤ 1% (v/v)
אתנול ≤ 5% (v/v)

טבלה 1: סיכום של reagents והפרמטרים שיש לקחת בחשבון במהלך תוואי עיכוב GST.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודת מחקר זו נתמכה על ידי קרן CANSEARCH. המחברים רוצים להכיר בגברת לורנס לסן ומר יון סרמינטו לסיוע טכני, במיוחד בביצוע הניסויים המשכפלים תוך סטנדרטיזציה של ההתייענות עם מעכבים. דיונים ותשומות פוריים של מר דניס מרינו, ד”ר סימונה מלקר וד”ר ויד מלקר מוכרים מאוד. אנו מודים לד”ר פטרישיה הואזו-דיאז קרטיס על עזרתה בהקריינות של הסרטון. אנו מודים לד”ר מוטוקומאר על תשומותיו בתחזיות סיליקו. אנו מודים גם למר דארן הארט על עזרתו בקריאה של כתב היד הזה.

Materials

1-Chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) Sigma-Aldrich 237329 Substrate used for the GST enzymatic assay
Corning UV-Transparent Microplates Sigma-Aldrich CLS3635 Transparent plate to perform the enzymatic assay.
When using 200 ul, the pathlength is 0.552 cm for this plate.
Curcumin Sigma-Aldrich 8511 Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 To prepare the stock of the putative inhibitor
DPBS Sigma-Aldrich D8537 Buffer for the enzymatic reaction
Ethanol 95% Fisher scientific 10542382 To dilute the CDNB
Glutathione S-Transferase from equine liver Sigma-Aldrich G6511 Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin
L-glutathione reduced (GSH) Sigma-Aldrich G4251 Co-substrate for the GST enzymatic assay
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23225 To quantify the amount of protein present in the enzymatic solution
Spectramax iD3 Molecular devices To do spectrophotometric measurments
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mannervik, B., Danielson, U. H. Glutathione transferases–structure and catalytic activity. CRC Critical Reviews in Biochemistry. 23 (3), 283-337 (1988).
  2. Awasthi, Y. C., Sharma, R., Singhal, S. S. Human glutathione S-transferases. The International Journal of Biochemistry. 26 (3), 295-308 (1994).
  3. Rowe, J. D., Nieves, E., Listowsky, I. Subunit diversity and tissue distribution of human glutathione S-transferases: interpretations based on electrospray ionization-MS and peptide sequence-specific antisera. Biochemical Journal. 325, 481-486 (1997).
  4. Beckett, G. J., Hayes, J. D. Glutathione S-transferases: biomedical applications. Advances in Clinical Chemistry. 30, 281-380 (1993).
  5. Oakley, A. Glutathione transferases: a structural perspective. Drug Metabolism Reviews. 43 (2), 138-151 (2011).
  6. Townsend, D. M., Tew, K. D. The role of glutathione-S-transferase in anti-cancer drug resistance. Oncogene. 22 (47), 7369-7375 (2003).
  7. Tew, K. D. Glutathione-associated Enzymes in Anticancer Drug Resistance. Cancer Research. 54 (16), 4313-4320 (1994).
  8. Laborde, E. Glutathione transferases as mediators of signaling pathways involved in cell proliferation and cell death. Cell Death and Differentiation. 17 (9), 1373-1380 (2010).
  9. Adler, V., et al. Regulation of JNK signaling by GSTp. The EMBO Journal. 18 (5), 1321-1334 (1999).
  10. Cho, S. G., et al. Glutathione S-Transferase Mu Modulates the Stress-activated Signals by Suppressing Apoptosis Signal-regulating Kinase 1. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12749-12755 (2001).
  11. Hayes, J. D., Flanagan, J. U., Jowsey, I. R. Glutathione Transferases. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 45 (1), 51-88 (2005).
  12. Lo, H. W., Ali-Osman, F. Genetic polymorphism and function of glutathione S-transferases in tumor drug resistance. Current Opinion in Pharmacology. 7 (4), 367-374 (2007).
  13. Ansari, M., et al. Glutathione S-transferase gene variations influence BU pharmacokinetics and outcome of hematopoietic SCT in pediatric patients. Bone Marrow Transplantation. 48 (7), 939-946 (2013).
  14. Mahajan, S., Atkins, W. M. The chemistry and biology of inhibitors and pro-drugs targeted to glutathione S-transferases. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 62 (11), 1221-1233 (2005).
  15. Allocati, N., Masulli, M., Ilio, C. D., Federici, L. Glutathione transferases: substrates, inihibitors and pro-drugs in cancer and neurodegenerative diseases. Oncogenesis. 7 (1), 8 (2018).
  16. Aggarwal, B. B., Kumar, A., Bharti, A. C. Anticancer potential of curcumin: preclinical and clinical studies. Anticancer Research. 23 (1), 363-398 (2003).
  17. Han, S. S., Chung, S. T., Robertson, D. A., Ranjan, D., Bondada, S. Curcumin causes the growth arrest and apoptosis of B cell lymphoma by downregulation of egr-1, c-myc, bcl-XL, NF-kappa B, and p53. Clinical Immunology. 93 (2), 152-161 (1999).
  18. Golonko, A., Lewandowska, H., Świsłocka, R., Jasińska, U. T., Priebe, W., Lewandowski, W. Curcumin as tyrosine kinase inhibitor in cancer treatment. European Journal of Medicinal Chemistry. 181, 111512 (2019).
  19. Awasthi, S., et al. Curcumin-glutathione interactions and the role of human glutathione S-transferase P1-1. Chemico-Biological Interactions. 128 (1), 19-38 (2000).
  20. Appiah-Opong, R., Commandeur, J. N. M., Istyastono, E., Bogaards, J. J., Vermeulen, N. P. E. Inhibition of human glutathione S-transferases by curcumin and analogues. Xenobiotica; the Fate of Foreign Compounds in Biological Systems. 39 (4), 302-311 (2009).
  21. Dubey, V., Owusu-Apenten, R. Curcumin Restores Glutathione-S-Transferase Activity for LNCaP Prostate Cancer Cells. Pure and Applied Chemistry. 2, 61-72 (2014).
  22. Habig, W. H., Pabst, M. J., Jakoby, W. B. Glutathione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation. The Journal of Biological Chemistry. 249 (22), 7130-7139 (1974).
  23. Johnson, K. A., Goody, R. S. The Original Michaelis Constant: Translation of the 1913 Michaelis-Menten Paper. Biochemistry. 50 (39), 8264-8269 (2011).
  24. Ochs, R. S. Understanding Enzyme Inhibition. Journal of Chemical Education. 77 (11), 1453 (2000).
  25. Bisswanger, H. Enzyme assays. Perspectives in Science. 1 (1), 41-55 (2014).
  26. Acker, M. G., Auld, D. S. Considerations for the design and reporting of enzyme assays in high-throughput screening applications. Perspectives in Science. 1 (1), 56-73 (2014).
  27. Cheng, A. L., et al. . Anticancer Research. 21, 2895-2900 (2001).
  28. Yang, J., Copeland, R. A., Lai, Z. Defining Balanced Conditions for Inhibitor Screening Assays That Target Bisubstrate Enzymes. Journal of Biomolecular Screening. 14 (2), 111-120 (2009).
  29. Uppugunduri, C. R. S., Muthukumaran, J., Santos-Silva, T., Ansari, M. Identification of putative substrates and inhibitors for Glutathione S-transferases using computational methods. Zenodo. , (2017).
  30. Burlingham, B. T., Widlanski, T. S. An Intuitive Look at the Relationship of Ki and IC50: A More General Use for the Dixon Plot. Journal of Chemical Education. 80 (2), 214 (2003).
  31. Wang, Y. J., et al. Stability of curcumin in buffer solutions and characterization of its degradation products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 15 (12), 1867-1876 (1997).
  32. Copeland, R. A. Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. A guide for medicinal chemists and pharmacologists. Methods of Biochemical Analysis. 46, 1 (2005).
  33. Kalliokoski, T., Kramer, C., Vulpetti, A., Gedeck, P. Comparability of Mixed IC50 Data – A Statistical Analysis. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
  34. Brandt, R. B., Laux, J. E., Yates, S. W. Calculation of inhibitor Ki and inhibitor type from the concentration of inhibitor for 50% inhibition for Michaelis-Menten enzymes. Biochemical Medicine and Metabolic Biology. 37 (3), 344-349 (1987).
  35. Brooks, H. B., et al. Basics of Enzymatic Assays for HTS. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2012).
  36. Arakawa, S., et al. Evaluation of hepatic glutathione transferase Mu 1 and Theta 1 activities in humans and mice using genotype information. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 40 (3), 497-503 (2012).
  37. Sherratt, P. J., Pulford, D. J., Harrison, D. J., Green, T., Hayes, J. D. Evidence that human class Theta glutathione S-transferase T1-1 can catalyse the activation of dichloromethane, a liver and lung carcinogen in the mouse. Comparison of the tissue distribution of GST T1-1 with that of classes Alpha, Mu and Pi GST in human. The Biochemical Journal. 326 (3), 837-846 (1997).

Tags

Spectrophotometric ScreeningCytosolic Glutathione S-transferasesGST InhibitorsEnzymatic ActivityInhibitory ConcentrationMode Of InhibitionCDNBGSHPBS

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Robin, S. K. D., Ansari, M., Uppugunduri, C. R. S. Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases. J. Vis. Exp. (164), e61347, doi:10.3791/61347 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image