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Biochemistry

Dépistage spectrophotométrique des inhibiteurs potentiels du glutathion cytosolique S-Transferases

Published: October 10, 2020
doi:
10.3791/61347
, ,
1Research platform of Pediatric Onco-Hematology, Department of Paediatrics, Gynaecology and Obstetrics, Faculty of Medicine,University of Geneva, 2Section of Biology, Faculty of Science,University of Geneva, 3Onco-Hematology Unit, Department of Women, Children-Adolescents,University Hospitals of Geneva

Summary

Les glutathion S-transferases (GST) sont des enzymes de désintoxication impliquées dans le métabolisme de nombreux médicaments chimiothérapeutiques. La surexpression des TSG est corrélée à la résistance à la chimiothérapie contre le cancer. Une façon de contrer ce phénotype est d’utiliser des inhibiteurs. Ce protocole décrit une méthode utilisant un test spectrophotométrique pour dépister les inhibiteurs potentiels de la TPS.

Abstract

Les glutathion S-transferases (GST) sont des enzymes métaboliques responsables de l’élimination des composés électrophiliques endogènes ou exogènes par conjugaison de glutathion (GSH). En outre, les TSG sont des régulateurs des kinases de protéines activées par le mitogène (MAPKs) impliquées dans les voies apoptotiques. La surexpression des TSG est corrélée avec l’efficacité thérapeutique diminuée parmi les patients subissant la chimiothérapie avec des agents alcalinants électrophiliques. L’utilisation d’inhibiteurs de la TPS peut être une solution potentielle pour inverser cette tendance et augmenter la puissance du traitement. La réalisation de cet objectif nécessite la découverte de tels composés, avec un test enzymatique précis, rapide et facile. Un protocole spectrophotométrique utilisant le 1-chloro-2,4-dinitrobenzène (CDNB) comme le substrat est la méthode la plus employée dans la littérature. Cependant, les expériences d’inhibition de la TPS déjà décrites ne fournissent pas de protocole détaillant chaque étape d’un test d’inhibition optimal, comme la mesure de la constante Michaelis-Menten (Km)pour le CDNB ou l’indication de la concentration enzymatique utilisée, des paramètres cruciaux pour évaluer la puissance d’inhibition d’un composé testé. Par conséquent, avec ce protocole, nous décrivons chaque étape d’un test spectrophotométrique optimisé enzymatique de la TPS, afin de filtrer les bibliothèques d’inhibiteurs potentiels. Nous expliquons le calcul de la concentration inhibitrice demi-maximale (IC50) et de la constante d’inhibition (Ki)—deux caractéristiques utilisées pour mesurer la puissance d’un inhibiteur enzymatique. La méthode décrite peut être mise en œuvre à l’aide d’un pool de TSG extraits de cellules ou de GST humains recombinants purs, à savoir TPS alpha 1 (GSTA1), GST mu 1 (GSTM1) ou TPS pi 1 (GSTP1). Toutefois, ce protocole ne peut pas être appliqué à la TPS theta 1 (GSTT1), car la CDNB n’est pas un substrat pour cette isoforme. Cette méthode a été utilisée pour tester la puissance d’inhibition de la curcumine à l’aide de GSTs du foie équin. La curcumine est une molécule présentant des propriétés anticancéreuses et a montré une affinité avec les isoformes de la TPS après avoir dans les prédictions d’amarrage silico. Nous avons démontré que la curcumine est un puissant inhibiteur concurrentiel de la TPS, avec un IC50 de 31,6 ± 3,6 μM et un Ki de 23,2 ± 3,2 μM. La curcumine a le potentiel d’être combinée avec des médicaments de chimiothérapie électrophilique pour améliorer son efficacité.

Introduction

Les enzymes cytosoliques du glutathion S-transférase (GST, EC 2.5.1.18) catalysent la conjugaison du glutathion (GSH) en divers composés électrophiliques, tels que les agents chimiothérapeutiques, pour les détoxifier et les éliminer facilement du corps1. Sept isoformes de TPS cytosolique ont été identifiés comme alpha, mu, pi, sigma, oméga, theta, et zeta. Les TSG sont principalement exprimés dans le foie, les testicules, les poumons et le tractus gastro-intestinal2. L’isoforme de la TPS alpha 1 (GSTA1) est fortement exprimée en hépatocytes. Le corps exprime de façon hétérogène d’autres sous-types, y compris la TPS pi 1 (GSTP1) principalement dans le cerveau, le cœur et les poumons, et la TPS mu 1 (GSTM1) dans le foie et les testicules3. Bien qu’il existe une homologie à haute séquence entre les isoformes de la TPS, chacune présente une spécificité de substrat et est impliquée dans le métabolisme des médicaments et le cancer de différentes façons, selon son expression différentielle4,5.

Les composés électrophiliques pénètrent dans le corps exogènement ou sont produits endogènement. Pesticides, prostaglandines, cancérogènes et médicaments chimiothérapeutiques sont quelques-uns des substrats potentiels pour les réactions de conjugaison de glutathion6. Par exemple, tout composé réactif déficient en électrons formé dans une cellule est susceptible de devenir un substrat électrophilique. Les agents alcalins tels que le chlorambucil ou le melphalan sont éliminés comme conjugués de GSH catalysés par les GST, et des niveaux accrus de ces enzymes ont été corrélés avec la résistance à ces composés6,7.

Un autre rôle important des GST cytosoliques est la régulation de l’activité des kinases de protéines activées par le mitogène (MAPK) telles que MAPK8 (également connu sous le nom de kinase c-Jun N-terminal, ou JNK1) et MAP3K5 (également connu sous le nom de kinase 1 régulateur du signal d’apoptose, ou ASK1)8. Certaines isoformes dans leur conformation monomérique se lieront à ces protéines et bloqueront ainsi la cascade de phosphorylation. Dans des conditions normales, l’isoforme GSTP1 séquestrera MAPK8 (l’activateur de la protéine c-Jun). La combinaison du c-Jun avec la protéine c-Fos forme le facteur de transcription de la protéine activateur 1 (AP-1), qui est responsable de la transcription des gènes pro-apoptotiques. Dans les cellules stressées, le complexe formé par GSTP1 et MAPK8 se dissocie, c-Jun est activé, et les gènes menant à l’apoptose commencent à êtreexprimés 9. Une plus grande expression de cette isoforme de LA TPS pourrait donc bloquer la voie, conduisant à une viabilité cellulaire accrue, à une prolifération cellulaire accrue et à une sensibilité cellulaire plus faible à la chimiothérapie. Des scénarios similaires peuvent se produire avec des paralogs de GSTP1, par exemple, GSTM1, qui interagit avec MAP3K510.

Les rôles joués par les GST dans le métabolisme des médicaments et dans la séquestration des MAPKs ont conduit à l’hypothèse qu’une plus grande expression des TSG pourrait être un signe d’un mécanisme de résistance tumorale au traitement chimiothérapeutique6,11. Par exemple, GSTP1 est surexprimé dans de nombreux cancers et sa présence a été corrélée avec un pronostic médiocre et une incidence accrue de rechute8. Le polymorphisme dans ces gènes a également montré l’exposition différentielle de drogue et les taux de survie pour des patients présentant diverses maladies, renforçant l’idée que ces enzymes sont cruciales pour des mécanismes de résistance aux médicaments. Par exemple, les personnes atteintes du génotype null GSTM1 sont associées à une réduction du dédouanement des médicaments et à une meilleure survie12,13. Il existe plusieurs moyens potentiels de contrer cette surexpression, comme l’utilisation d’analogues GSH, de prodrugs qui sont activés par conjugaison avec des GST, ou d’inhibiteurs directs de la TPS14,15.

Toutes ces méthodes sont actuellement à l’étude, et quelques composés ont commencé des essais cliniques pour leur utilisation potentielle parmi les patients. Toutefois, à notre connaissance, il n’y a pas de composés utilisés comme inhibiteurs de la TPS dans les milieux cliniques15. En effet, un manque de spécificité pour certains isoformes ou l’épuisement de GSH dans les cellules normales, qui peuvent conduire à des toxicités causées par l’accumulation d’espèces réactives d’oxygène (ROS) dans les systèmes d’organes, ne sont que quelques-uns des inconvénients qui réduisent le potentiel des inhibiteurs de la TPS14,15. Le risque que ces composés exercent d’autres effets pharmacodynamiques sur le corps limite également leur utilisation. L’acide éthachynique, par exemple, est l’inhibiteur de la TPS le plus largement étudié dans les milieux de laboratoire, mais parce qu’il est principalement utilisé comme un diurétique fort, cette propriété limite son utilisation en combinaison avec d’autres médicaments dans les milieux cliniques. La curcumine est un autre composé naturel qui a été examiné avec succès comme inhibiteur de la TPS. Cette molécule est un éther polyphénol extrait de l’espèce de curcuma longa de curcuma. Il a montré des résultats prometteurs comme une option de traitement possible contre le cancer en induisant l’apoptose de divers types de lignées cellulaires tumorales16,17. Le composé peut réglementer diverses voies cellulaires, comme la tyrosine kinase18 ou la voie de la TPS. Des études avec des protéines pures ont montré sa puissance d’inhibition sur GSTA1, GSTM1 et GSTP119,20. Cependant, des résultats contradictoires ont été observés dans les cellules cancéreuses, où une plus grande activité intracellulaire de LA TPS a été mesurée lorsque les cellules ont été traitées avec la curcumine21. Ainsi, il est important d’étudier la concentration inhibitrice demi-maximale (IC50) et la constante d’inhibition (Ki)de tout inhibiteur putatif de la TPS en utilisant un protocole clairement décrit avec des contrôles appropriés avant de planifier d’autres expériences cellulaires.

Le dépistage et l’essai de nouveaux inhibiteurs potentiels de la TPS sont donc d’un intérêt clinique important, et tout nouveau composé trouvé doit être sûr et efficace pour être utilisé en combinaison avec des médicaments électrophiles. La focalisation de la recherche sur les inhibiteurs isoformes pourrait permettre l’inhibition de la TPS dans les tissus tumoraux présentant des modèles spécifiques d’expression de la TPS, permettant ainsi le développement d’une thérapie combinée efficace. Trouver des inhibiteurs avec des modes d’inhibition différentiels pourrait également être d’intérêt. Par exemple, un inhibiteur concurrentiel qui utilise GSH comme substrat peut induire son épuisement. Cette réduction de la concentration de GSH dans les cellules a été montrée pour induire le stress oxydatif dans les neurones, menant à l’apoptose. Un autre mode commun d’inhibition — l’inhibition non compétitive — ne peut pas être inversé même si le substrat est présent en concentrations élevées.

Le taux d’activité enzymatique est représenté par la constante Michaelis-Menten (Km)et la vitesse maximale (Vmax),qui peut être déterminée en traçant un graphique Michaelis-Menten, avec la concentration du substrat par rapport à la vitesse de la réaction23. Km est la concentration de substrat nécessaire pour occuper la moitié des sites actifs enzymatiques, ce qui signifie qu’un Km élevé représente moins d’affinité. Vmax représente la vitesse maximale de la réaction, atteinte lorsque tous les sites actifs sont occupés par le substrat. Km est égal à la moitié Vmax. Il existe trois modes d’inhibition les plus courants : compétitif, non compétitif et non compétitif. En cas d’inhibition compétitive, l’inhibiteur se lie au site actif de l’enzyme et rivalise avec le substrat. Par conséquent, Vmax ne change pas après l’ajout de l’inhibiteur, mais Km augmente, comme plus de substrat est nécessaire pour contrer l’inhibition. L’inhibition non compétitive ne se produit que lorsque le substrat forme un complexe avec l’enzyme. Dans ce cas, comme le niveau d’inhibition dépend du substrat et de la concentration enzymatique, Vmax et Km diminuent lorsque l’inhibiteur est ajouté à la réaction. Le dernier mode d’inhibition n’est pas compétitif et est un mélange des deux autres modèles d’inhibition. L’inhibiteur peut se lier au site actif de l’enzyme, que l’enzyme soit liée à son substrat ou non. Ici Vmax diminue après l’ajout de l’inhibiteur, mais Km ne change pas24.

Un essai spectrophotométrique qui mesurait l’activité de la TPS a été élaboré pour la première fois par Habig et coll. en 1974 en utilisant le 1-chloro-2,4-dinitrobenzène (CDNB) comme substrat de la réaction22. La conjugaison entre GSH et CDNB forme GS-DNB, qui présente une absorption maximale de la lumière à la longueur d’onde de 340 nm, enregistrée avec un spectrophotomètre. La plupart de la technique expliquée ci-dessous est dérivée de Habig et al., y compris des informations sur les meilleurs paramètres et des points d’optimisation importants pour un test inhibiteur. La technique peut être appliquée au dépistage des inhibiteurs potentiels de la TPS, qu’ils soient choisis par sélection rationnelle des médicaments à l’aide de prédictions computationnelles ou par examen de la littérature. On discute également de la façon d’adapter le protocole aux protéines nouvellement synthétisées de la TPS ou aux isoformes spécifiques. Par exemple, l’essai de la puissance d’inhibiteur des isoformes de TPS présentant un polymorphisme cliniquement pertinent ou des polymorphismes mononucléotides (SNP) pourrait être des utilisations potentielles pour ce protocole, ciblant les GST spécifiques au patient.

Ce protocole fournit une méthode rapide, réalisable et efficace pour le dépistage in vitro des inhibiteurs potentiels de la TPS avant toute autre étude fonctionnelle. Les étapes nécessaires pour évaluer les caractéristiques les plus fréquemment mesurées d’un inhibiteur enzymatique sont décrites : la concentration inhibitrice 50 (IC50) qui est la concentration d’inhibiteur nécessaire pour diminuer l’activité enzymatique de moitié; et la constante d’inhibition (Ki) qui représente la constante d’équilibre de la dissociation entre l’inhibiteur et l’enzyme, caractéristique de l’affinité entre ces deux molécules. Ces deux valeurs sont mesurées par régression non linéaire et à l’aide d’équations spécifiques pour chaque mode d’inhibition, respectivement. Nous démontrons également l’évaluation de ce modèle d’inhibition, en utilisant des parcelles Michaelis-Menten pour déterminer le changement de Vmax et Km après l’ajout de l’inhibiteur23,25,26.

Protocol

1. Préparation de la solution enzymatique de la TPS REMARQUE : La procédure de préparation de la solution enzymatique dépend de la fait que les unités d’activité enzymatique sont connues avant l’essai. Une unité enzymatique est la quantité d’enzyme nécessaire pour synthétiser 1 μmol de produit par minute. L’activité enzymatique est représentée en unité/mL ou μmol/min/mL et dépend de la dilution de la solution enzymatique. L’activité enzymatique spécifique est représentée en unité/mg ou μmol/min/mg et dépend uniquement de la pureté de la solution. Ces deux caractéristiques sont déterminées ci-dessous. Si l’unité enzymatique d’une isoforme de TPS isolée est inconnue, il faut l’estimer pour ajuster les concentrations enzymatiques pour chaque réaction et fournir des résultats reproductibles. Si l’unité enzymatique de la TPS utilisée dans l’essai est connue : Préparer une solution de stock frais de l’enzyme TPS à 0,1 U/mL dans l’eau, puis procéder à l’étape 2.REMARQUE : Cette solution peut être stockée à -20 °C dans des aliquots pendant plusieurs mois ou à -80 °C pendant de plus longues périodes, mais le cycle de gel/dégel doit être évité. Si l’unité enzymatique de la TPS utilisée dans l’essai est inconnue : Quantifier la concentration de protéines de la solution enzymatique à l’aide d’un test de protéines d’acide bicinchoninique (BCA) ou de tout autre kit. Diluer la solution protéique à une concentration finale de protéines de 0,02 mg/mL. Ajouter 20 μL de la solution enzymatique, 20 μL de GSH 25 mM (poids moléculaire : 307,32 g/mol) et 150 μL de la solution saline tamponnée de phosphate (DPBS) de Dulbecco à une plaque de 96 puits. Pour le blanc, ajouter 20 μL d’eau au lieu de la solution enzymatique. Ajouter 10 μL de substrat CDNB 50 mM (poids moléculaire : 202,55 g/mol) à chaque puits. Sur un lecteur de microplaque spectrophotométrique, définissez les paramètres de lecture des puits à 340 nm. Il est recommandé de mesurer l’absorption chaque minute pendant 10 minutes. Insérez la plaque dans le lecteur de microplaque, et commencez la lecture selon les paramètres de l’étape 1.2.5. Calculer la variation de l’absorption par minute pour les échantillons enzymatiques et le blanc.REMARQUE : Vérifiez que la réaction est linéaire en traçant l’absorption sur l’axe y et les minutes sur l’axe x. Si la réaction n’est pas linéaire et atteint un plateau, cela signifie que tout le substrat est utilisé et la réaction est trop rapide. Ainsi, réduire la quantité d’enzyme ajoutée au puits en diluant la solution de stock par deux. Corriger à blanc les lectures d’absorption des échantillons d’essai. Avec l’équation 1, représentant la loi Beer–Lambert, calculer la concentration de GS-DNB formée (en μM) par la réaction chaque minute.Équation 1 :où C est la concentration du substrat en μM, A340/min est le changement d’absorption par minute, tel que mesuré à l’étape 1.2.7, ε est le coefficient d’extinction molaire pour le conjugué CDNB à 340 nm (0,0096 μM-1*cm-1),et l est la longueur de la trajectoire lumineuse dans le puits (en cm). Pour une plaque de 96 puits remplie de 200 μL de solution enzymatique, la longueur du chemin est d’environ 0,55 cm. Cette valeur peut varier selon le modèle de plaque et doit être vérifiée avec le fabricant. Pour déterminer la quantité de produit présente dans un puits en μmol/min, multipliez les résultats trouvés à l’aide de l’équation 1 par le volume de solution, 2 x 10-4 L. Normaliser l’activité par quantité de protéines utilisée en divisant les résultats de l’étape 1.2.9 par 4 x 10-4 mg. Le résultat est l’activité enzymatique spécifique dans l’unité/mg ou μmol/min/mg.REMARQUE : Si la dilution a été modifiée à l’étape 1.2.6, en raison d’une réaction non linéaire, ajuster la quantité de protéines en conséquence. Pour trouver l’activité enzymatique, ajuster les résultats à la concentration de protéines en mg/mL en multipliant l’activité enzymatique spécifique trouvée à l’étape 1.2.10 par 0.002 mg/mL. Cela donnera l’activité enzymatique dans l’unité/mL ou μmol/min/mL.REMARQUE : Contrairement à l’activité enzymatique, cette mesure ne changera pas en fonction de la dilution de la solution protéique. Même note que l’étape 1.2.10, mais pour la concentration de protéines. Préparer une solution de stock de l’enzyme TPS à 0,1 unité/mL dans l’eau, puis passer à l’étape 2.REMARQUE : Cette solution peut être stockée à -20 °C dans des aliquots pendant plusieurs mois ou à -80 °C pendant de plus longues périodes, mais le cycle de gel/dégel doit être évité. Le contrôle de l’activité enzymatique est recommandé si les expériences sont menées pendant une longue période de temps car la dégradation de la solution protéique pourrait se produire. 2. Mesure de la constante Michaelis-Menten de l’isoforme de la TPS pour la CDNB REMARQUE : La procédure est expliquée pour un substrat CDNB mais peut être appliquée à n’importe quel autre substrat, tel que GSH. Chaque concentration de CDNB a besoin de son propre blanc, car l’absorption à 340 nm augmentera selon la concentration de CDNB. Préparer six concentrations différentes de CDNB, allant de 10 mM à 100 mM, en éthanol à 95 % (v/v). Préparer la solution d’essai, avec 10 μL de CDNB, 20 μL d’enzyme de GST, 20 μL de GSH 25 mM et 150 μL DPBS. Pour le blanc, au lieu de la solution CDNB, ajouter seulement 10 μL d’éthanol 95%. Préparer un blanc pour chaque concentration de CDNB, avec 10 μL de CDNB, 20 μL d’eau, 20 μL de GSH 25 mM et 150 μL DPBS. Enregistrez l’absorption à 340 nm chaque minute pendant 10 minutes avec un lecteur de microplaques. Corriger l’absorption en soustrayant les résultats du blanc de ceux des autres puits d’essai corrects. Selon les valeurs mesurées, calculer la vitesse de la réaction à l’aide de l’équation 2.Équation 2 :où a340/min est le changement d’absorption déterminé expérimentalement par minute, Vtotal (volume total) est égal à 0,2 mL,enzyme V (volume d’enzyme) est de 0,02 mL, et εGS-DNB est le coefficient d’extinction molaire du conjugué GS-DNB à 340 nm (9,6 mM-1*cm-1). Dans un puits de 200 μL d’une plaque de 96 puits, la longueur du chemin est de 0,55 cm (selon le type de plaque) et le coefficient d’extinction est égal à 5,3 mM-1. La vitesse peut être représentée soit par μmol/mL/min, soit par mM/min. Tracez le graphique Michaelis-Menten avec la vitesse (sur l’axe y) contre la concentration du substrat (sur l’axe x). Définissez la vitesse maximale (Vmax)de la réaction et la constante Michaelis-Menten (Km)(c.-à-d. la concentration du substrat à la moitié de Vmax).REMARQUE : À l’aide d’un logiciel tel que GraphPad Prism, la courbe cinétique enzymatique peut être installée à l’aide d’une régression non linéaire pour le calcul des paramètres cinétiques enzymatiques Michaelis–Menten, tels que Vmax et Km. Préparer une solution de stock CDNB à 20 fois le Km calculé en éthanol 95% (v/v). 3. Absorption de l’inhibiteur potentiel de la TPS REMARQUE : Cette étape est effectuée pour déterminer si l’inhibiteur potentiel de la TPS utilisé dans la réaction produit un métabolite qui augmente l’absorption à la longueur d’onde mesurée. Si c’est le cas, la quantité d’inhibiteur utilisée aura un impact sur les résultats et un blanc spécifique doit être préparé pour chaque concentration. Diluer l’inhibiteur aux concentrations requises.REMARQUE : Préparez trois dilutions différentes, de préférence les concentrations les plus basses, moyennes et les plus élevées testées lors de l’essai d’inhibition. La concentration maximale de DMSO dans le puits doit être égale ou inférieure à 1 % (v/v). Nous avons testé l’effet de la concentration de DMSO sur l’essai dans notre laboratoire, et 1 % n’ont pas modifié de façon significative l’activité de la TPS. Dans une plaque de 96 puits, ajouter 2 μL de l’inhibiteur potentiel de la TPS, 20 μL de GSH 25 mM et 168 μL de DPBS. Utilisez un contrôle approprié, sans inhibiteur, en ajoutant des volumes égaux du solvant utilisé pour les échantillons d’inhibiteurs. Incuber la réaction pendant 10 minutes, pour commencer la réaction enzymatique.REMARQUE : Cette étape peut être optimisée, en testant différents temps d’incubation, avec les deux objectifs de commencer la réaction tout en évitant l’épuisement total du substrat. Ajouter 10 μL de CDNB à chaque puits pour obtenir une concentration finale au Km trouvé à l’étape 2. Agiter la plaque pendant quelques secondes. Enregistrez l’absorption à 340 nm chaque minute pendant 10 minutes avec un lecteur de microplaques. Calculer la variation de l’absorption par minute. Vérifiez le changement d’absorption par rapport à la réaction blanche et à la réaction négative de contrôle sans inhibiteur. S’il y a un changement significatif, utilisez le blanc pour chaque concentration d’inhibiteur afin d’ajuster les résultats.REMARQUE : Ce résultat indique que les constituants de la réaction, sans enzyme de TPS, réagissent spontanément et produisent un métabolite qui augmente l’absorption à 340 nm. Pour corriger cette absorption supplémentaire, un blanc spécifique doit être mesuré pour chaque concentration. S’il n’y a pas de changement significatif dans l’absorption, utilisez un blanc général, contenant uniquement le solvant utilisé pour la dilution de l’inhibiteur de la TPS, pour toutes les concentrations. 4. Essai d’inhibition de l’évaluation de la TPS et de l’IC50 Préparer neuf concentrations de l’inhibiteur potentiel de la TPS.REMARQUE : Les concentrations peuvent être adaptées en fonction des résultats. L’objectif est de définir les plateaux inférieurs et supérieurs de la courbe de régression non linéaire. Consultez la section discussion pour plus de détails sur cette étape. Préparer la solution d’analyse en diluant 20 μL de la solution GSH à 25 mM avec 148 μL de DPBS. Adapter le volume en fonction du nombre de puits utilisés dans l’essai. Dans une plaque claire de 96 puits, préparer la réaction enzymatique dans un volume final de 190 μL. Il est recommandé d’utiliser une pipette multicanal pour ces étapes. Pour les puits d’essai, ajoutez 20 μL de la solution enzymatique, 2 μL de la solution d’inhibiteur potentiel de la TPS et 168 μL de la solution d’essai. Pour le contrôle, ajouter 20 μL de la solution enzymatique, 2 μL du diluant utilisé pour l’inhibiteur de la TPS et 168 μL de la solution d’essai. Pour les puits vierges, ajouter 20 μL d’eau, 2 μL de l’inhibiteur potentiel de la TPS et 168 μL de la solution d’essai.REMARQUE : Si l’inhibiteur de la TPS absorbe la longueur d’onde de 340 nm, un blanc spécifique doit être préparé pour chaque concentration testée. Ajouter 10 μL de la solution CDNB à 20 x Km à chaque puits, y compris le blanc. Il est recommandé d’utiliser une pipette multicanal pour cette étape. Agiter la plaque pendant quelques secondes. Mesurez l’absorption à 340 nm chaque minute pendant 10 minutes à l’aide d’un lecteur de microplaques. Corriger l’absorption en soustrayant les résultats du test bien blancs. Normaliser les résultats en divisant les valeurs obtenues à l’aide de la solution d’inhibiteur de la TPS par l’absorption par minute du contrôle sans inhibiteur. Tracer les graphiques de régression non linéaires de la concentration logarithmique (x-axe) de l’inhibiteur par rapport à l’activité de la TPS (axe y), et déterminer ainsi l’IC50.NOTE: GraphPad Prism calcule l’IC50 à partir des parcelles de régression non linéaires en prédisant la concentration qui montrera 50% de l’activité enzymatique dans le contrôle. La prédiction est basée sur les plateaux inférieurs et supérieurs, ainsi que sur la courbe de la pente formée par le graphique sigmoid. 5. Évaluation du Kiet du type d’inhibition Préparer quatre concentrations différentes de CDNB : trois plus élevées et une égale au Km précédemment trouvé. Préparer trois concentrations différentes d’inhibiteurs de la TPS, égales ou inférieures à l’IC50 précédemment trouvé. Effectuez l’essai d’inhibition tel que décrit aux étapes 4.2 à 4.7. Calculer la vitesse des réactions à l’aide de l’équation 2. Tracez les graphiques michaelis-menten pour chaque concentration d’inhibiteurs et calculez le Vmax et le Km de chaque réaction. Selon les changements de Vmax et de Km lors de l’utilisation de différentes concentrations, évaluez le mode d’inhibition de l’inhibiteur de la TPS.REMARQUE : Cette étape est expliquée plus en détail dans les sections des résultats et de la discussion. Basé sur le mode d’inhibition, calculer le Ki.NOTE: Dans GraphPad Prism, différentes équations seront utilisées pour calculer le Ki en fonction de la nature de l’inhibition. Les équations utilisées sont basées sur le Km et Vmax observés après l’ajout de l’inhibiteur et par rapport aux Km et Vmaxdu contrôle .

Representative Results

Michaelis-Menten constante (Km) de CDNB avec TPS à partir de foie équineLa curcumine est un composé naturel sûr même après l’ingestion à des doses plus élevées27 qui ont montré des propriétés anticancéreuses16. La puissance d’inhibiteur de cette molécule a été démontrée sur les GST recombinants humains19,20. En utilisant le protocole décrit, nous avons évalué l’effet de la curcumine sur l’activité de la TPS à l’aide d’un pool d’isoformes de TPS provenant du foie équin. Selon le fournisseur, l’activité spécifique de ce mélange de protéines est de 25 U/mg. Une solution de stock de 0,1 U/mL a été préparée en dissolvant la poudre lyophilisée dans la quantité appropriée d’eau. L’acide éthacrynique a été utilisé en parallèle comme un contrôle positif car ce composé est l’inhibiteur de la TPS le plus largement utilisé dans les études. Les étapes de la mise en place d’un test d’activité de la TPS et de l’essai des inhibiteurs sont décrites à la figure 1. Le Km doit être défini pour chaque réaction de substrat enzymatique parce que l’utilisation de la concentration de substrat équivalente à Km n’assurerait aucun biais concernant la détermination du mode d’inhibition28. Six concentrations différentes de CDNB, allant de 0,5 mM à 5 mM, ont été testées pour mesurer ce paramètre, à l’aide d’une concentration fixe de 2,5 mM GSH. Le volume final de la réaction était de 200 μL, dans une plaque de 96 puits. Un blanc spécifique a été utilisé pour chaque expérience, utilisant la même concentration de CDNB que le puits d’essai parce que la conjugaison spontanée de CDNB et de GSH pourrait se produire et pourrait augmenter l’absorption. Une concentration finale enzymatique de 0,01 unité/mL a été utilisée pour toutes les réactions, en ajoutant 20 μL de la solution de stock au mélange d’essai. L’absorption à 340 nm a été enregistrée chaque minute pendant 10 minutes. La vitesse (en mM/min) de la réaction a été calculée à l’aide de l’équation 2. Un graphique de Michaelis–Menten a été tracé de la concentration de substrat (mM) par rapport à la vitesse (μM/min) (figure 2), et le Km de la réaction a été calculé. L’expérience a été répétée jusqu’à ce qu’au moins trois séries de données montrent des résultats similaires. Le Km de CDNB avec TPS à partir du foie équin a été mesuré comme 0,26 ± 0,08 mM. Une concentration de 0,2 mM de CDNB a été utilisée pour chaque essai inhibiteur à l’aide de ce lot de GST. Aucune formation spontanée d’un métabolite absorbé à 340 nm nm n’a été mesurée au cours d’expériences utilisant la curcumine incubée seule avec GSH et CDNB. Le même blanc a été utilisé pour chaque concentration d’inhibiteurs dans chaque expérience. Puissance d’inhibiteur de curcumine sur les GSTLa puissance d’inhibiteur de la curcumine a été prédite à l’aide d’une simulation d’amarrage en silico avec un logiciel (p. ex., AutoDock Vina version 1.1.2). 29 On a prédit l’énergie libre et contraignante entre les différents isoformes de la TPS (pTA1, GSTM1 et GSTP1) et la curcumine (données non présentées). Puis, la constante de l’inhibition Ki a été calculé à l’aide de l’équation 3. Équation 3 :où ∆G est l’énergie de liaison libre trouvée à l’aide de l’analyse in silico, R est la constante de gaz de 1.987 cal*K-1*mol-1, et T est la température pendant l’expérience, dans ce cas dans Kelvin (298 K). D’après les résultats énergétiques libres et contraignants retournés par l’AutoDock Vina, la curcumine est un puissant inhibiteur de la TPS chez les humains GSTA1, GSTM1 et GSTP1, avec des valeurs Ki de 78,1 μM, 78,1 μM et 27,4 μM respectivement. Les premiers tests inhibiteurs ont été effectués à l’aide de ces estimations computationnelles Ki, et les concentrations ont été ajustées en fonction des résultats, si nécessaire. Tout d’abord, l’IC50 a été estimé. Cette caractéristique est la concentration d’inhibiteur qui réduit le taux de réaction d’une enzyme de 50%. Il dépend donc de la concentration enzymatique30. Neuf concentrations finales de l’inhibiteur ont été préparées, allant de 0,39 μM à 100 μM, chaque concentration ayant doublé de celle du précédent. La solution d’essai était composée de 20 μL de GSH 2,5 mM, de 20 μL de TPS du foie équine à 0,01 U/mL final, 2 μL de la solution de curcumine et 148 μL de PBS. Le contrôle était composé de la même solution avec le diluant utilisé pour la curcumine. Ce mélange a été incubé pendant 15 minutes pour commencer l’essai enzymatique et pour éviter la dégradation de la curcumine dans la solution d’essai, car ce composé est instable dans les solutions tampon31. Ensuite, 10 μL de solution CDNB à 4 mM ont été ajoutés à chaque puits, pour une concentration finale de 0,2 mM CDNB. L’absorption à 340 nm a été enregistrée chaque minute pendant 10 minutes, pour calculer les changements d’absorption par minute. Pour calculer l’IC50, chaque échantillon incubé avec de la curcumine a été normalisé au contrôle, pour donner le pourcentage d’activité. Ces résultats ont été analysés à l’aide du logiciel de traçage en calculant la régression non linéaire de la concentration logarithmique de l’inhibiteur par rapport à l’inhibition. L’IC50 trouvé pour la curcumine sur la TPS du foie équine était de 31,6 ± 3,6 μM (figure 3A). La même expérience a été menée en parallèle à l’aide de l’acide éthacrynique comme contrôle positif, avec des concentrations allant de 0,39 à 100 μM, comme avec la curcumine. L’IC50 s’est avéré être de 6,6 ± 1,1 μM (figure 3B). L’étape suivante était d’évaluer le mode d’inhibition de la curcumine sur ces transferases. Quatre concentrations différentes de curcumine ont été testées : 0, 7,5, 15 et 30 μM, ainsi que quatre concentrations différentes de CDNB : 0,2, 0,4, 1 et 1,5 mM. Le protocole était le même que pour l’expérience précédente. La vitesse de chaque condition a été calculée à l’aide de l’équation 2. Une courbe a été tracée pour chaque concentration d’inhibiteurs, avec la vitesse (en μM/min) par rapport à la concentration de substrat (mM) (figure 3C). Le Vmax et Km ont été déterminés en fonction de chaque parcelle avec GraphPad Prism. Le mode d’inhibition de l’inhibiteur potentiel a été évalué en fonction des changements dans ces deux paramètres et de l’état différent des essais. 24 Comme Vmax n’a pas changé de façon significative entre les conditions, mais Km augmenté avec les différentes concentrations d’inhibiteurs, l’inhibition de la curcumine des GST est compétitive. Ce modèle d’inhibition se produit lorsque l’inhibiteur est en concurrence avec le substrat pour le site actif de l’enzyme. Pour mesurer le Ki d’un inhibiteur concurrentiel, GraphPad utilise l’équation 4 et l’équation 5 telles que décrites par Copeland et al.32.Équation 4 :Équation 5 :où Km obs est la constante observée michaelis-menten, Km est la constante Michaelis-Menten du contrôle, [I] est la concentration d’inhibiteur, Ki est la constante de l’inhibition, Y est la vitesse, et X est la concentration de substrat. Les calculs sont basés sur les mêmes expériences que l’évaluation du mode d’inhibition. Le Ki a estimé que l’inhibition de la TPS par la curcumine du foie équine était de 23,2 ± 3,2 μM. Figure 1 : Diagramme de flux décrivant les étapes des tests enzymatiques et d’inhibition de la TPS. Les détails sur la procédure sont présentés dans la section protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2 : Parcelle de Michaelis-Menten de l’activité enzymatique de la TPS. Une concentration accrue du substrat CDNB a été utilisée avec une concentration fixe de GSH (2,5 mM) pour déterminer l’activité de TPS à partir d’un pool de TPS provenant du foie équin. La valeurk m pour cdnb a été déterminée comme 0,26 ± 0,08 mM selon la courbe du graphique. Chaque point de données sur l’intrigue représente la moyenne de quatre différentes séries expérimentales avec SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : Effet de la curcumine et de l’acide éthacrynique sur l’activité enzymatique de la TPS. (A-B) L’ajout de concentrations croissantes de curcumine (A)ou d’acide éthacrynique de contrôle positif (B),tout en conservant la même TPS (0,01 U/mL), GSH (2,5 mM) et CDNB (0,2 mM) concentrations finales ont été utilisés pour calculer le IC50 des deux composés pour la TPS du foie équine avec une régression non linéaire. IC50 a été déterminé comme 31,6 ± 3,6 μM pour la curcumine et 6,6 ± 1,1 μM pour l’acide éthacrynique. (C) Parcelle de Michaelis–Menten de différentes concentrations de curcumine, testée sur des concentrations variables de substrat CDNB indiquant un mode d’inhibition compétitif. Sans inhibiteur, Vmax et Km ont été mesurés comme 132,7 ± 4,6 μM et 0,5 ± 0,08 μM, respectivement. Avec 30 μM de curcumine, Vmax et Km étaient de 130,4 ± 13,1 μM et 1,08 ± 0,39 μM. Les points de données dans tous les graphiques (A-C) représentent les moyens de trois séries expérimentales différentes avec SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Nous fournissons un protocole décrivant chaque étape d’un test enzymatique spectrophotométrique de TPS, pour dépister les inhibiteurs putatifs (figure 1, tableau 1) et quantifier leur puissance d’inhibiteur. Nous avons également mis l’accent sur les critères les plus cruciaux à considérer pour les tests enzymatiques précis fournissant des résultats reproductibles. Les principaux avantages du protocole décrit par rapport à d’autres méthodes colorimétriques ou spectrométrie de masse sont que ce protocole est rapide et facile à exécuter et fournit des mesures quantitatives de l’activité de la TPS ainsi que la puissance d’inhibition des molécules filtrées.

Nous présentons la façon de calculer les deux paramètres les plus importants de Michaelis–Menten d’un inhibiteur de l’enzyme : l’IC50 et le Ki. Un inhibiteur puissant exercera le plus bas possible Ki et IC50, indiquant que l’affinité entre l’inhibiteur et l’enzyme est élevée30. Comme IC50 dépend de la concentration enzymatique et des conditions d’essai33, il peut être difficile d’utiliser cette valeur pour comparer les inhibiteurs de différentes expériences ou obtenus en utilisant d’autres conditions d’essai34. L’utilisation de la constante de l’inhibition Ki est un meilleur indicateur de la puissance d’inhibiteur des composés potentiels. Ki peut être utilisé pour comparer deux inhibiteurs avec différents modes d’inhibition, car il repose uniquement sur l’affinité entre l’inhibiteur et l’enzyme. Cependant, pour avoir une idée claire de la nature de l’inhibition, il faut déterminer les deux paramètres de l’inhibiteur30. Nous avons mesuré ic50 et ki des curcumines comme 31,6 ± 3,6 μM et 23,2 ± 3,2 μM, respectivement, ce qui indique que ce composé est un inhibiteur puissant de la TPS. Ces résultats ont confirmé les prédictions in silico, qui ont estimé les valeurs Ki entre 27,4 à 78,1 μM pour les différentes isoformes et curcumine de la TPS humaine.

Activité enzymatique ou taux de réaction et quantité d’enzymes
Comme indiqué ci-dessus, IC50 dépend de la concentration enzymatique, et la réalisation d’une expérience avec un niveau inconnu d’activité enzymatique pourrait conduire à de fausses conclusions33. Pour contrôler d’autres facteurs, qui pourraient réduire l’activité inhibitrice, il faut tenir compte et mesurer l’activité enzymatique de chaque nouveau lot de TSG. Par exemple, la dégradation d’un lot enzymatique, causée par trop de cycles de gel/dégel, pourrait diminuer l’activité et donc conduire à une IC50 inférieure même si l’expérience a été menée dans les mêmes conditions. En d’autres termes, l’utilisation de 0,01 unités d’enzymes ne donnera pas les mêmes résultats que l’utilisation de 1 unité. L’utilisation de trop d’enzymes pourrait conduire à un épuisement rapide du substrat et la réaction n’aura pas de forme linéaire. Ce paramètre pourrait donc conduire à un résultat inexact, car aucun changement d’absorption ne serait observé après un long temps d’incubation.

Valeur Km
Pour assurer les meilleures conditions pour évaluer le type d’inhibition exposée par un inhibiteur, la concentration du substrat doit être égale ou inférieure à la constante Michaelis-Menten (Km). Km est représenté par la concentration de substrat nécessaire pour occuper la moitié des sites actifs sur l’enzyme28. Par exemple, une concentration plus élevée de substrat peut contrecarrer un inhibiteur concurrentiel et l’évaluation de ce type d’inhibition sera difficile dans un tel cadre. Ainsi, l’une des étapes cruciales de cette méthodologie est la détermination du Km de l’enzyme pour le substrat sélectionné (ici CDNB). Dans certaines études, cette valeur n’a pas été déterminée et cela pourrait conduire à de fausses conclusions sur le modèle d’inhibition causée par l’inhibiteur, et, si le mode d’inhibition est incorrect, le Ki sera calculé incorrectement que l’équation repose sur le modèle d’inhibition26,28. Si un autre isoforme de TPS est testé, une nouvelle évaluation de la valeur Km est obligatoire, car cette valeur est unique pour une paire d’enzymes et de ligand. Comme nous avons utilisé une concentration de CDNB légèrement inférieure au Km (0,2 mM), que nous avons définie comme 0,26 ± 0,08 mM, le mode concurrentiel prévu d’inhibition de la curcumine sur la TPS a été déterminé avec précision.

IC50
L’obtention d’une bonne courbe sigmoidal avec laquelle estimer l’IC50 nécessite de trouver à la fois les plateaux inférieurs et supérieurs. Le plateau inférieur représente les concentrations d’un inhibiteur qui fournissent l’activité inhibitrice maximale. Dans certains cas, un composé pourrait ne pas inhiber complètement l’enzyme, même à des concentrations élevées, en raison de problèmes techniques tels que la solubilité. Cependant, des outils comme GraphPad Prism peuvent s’adapter au plateau inférieur assez précisément. Le plateau supérieur est composé de concentrations de l’inhibiteur, qui sont insuffisantes pour inhiber l’enzyme, et donc l’activité est maximale. Ces deux plateaux sont essentiels à la détermination de l’IC50 ainsi que des concentrations entre les deux, afin de trouver la pente de la courbe, alors l’IC50 peut être dérivé de la forme de la courbe sigmoid35. La curcumine est mal soluble dans l’eau, donc la concentration maximale utilisée dans ce test est limitée, pour éviter les précipitations dans la solution d’essai. Ainsi, des solutions moins concentrées, qui n’entravent pas complètement l’activité de la TPS, ont été utilisées. Cela a soulevé des questions pour la détermination du plateau inférieur. Pour contrer ce problème, nous avons prédit des valeurs inférieures basées sur le graphique de régression non linéaire, qui a fourni un IC50 de 31,6 ± 3,6 μM pour la curcumine (figure 3A). Pour l’acide éthachynique, il n’était pas nécessaire de prédire les valeurs du plateau inférieur, car ce composé est soluble dans la solution d’essai et l’IC50 a été mesuré à 6,6 ± 1,1 μM.

Cette méthode peut être appliquée aux isoformes de TPS les plus exprimés chez l’homme, à savoir GSTA1, GSTM1 ou GSTP1. Toutefois, ce protocole n’est pas adapté pour quantifier l’activité de l’isoforme de la GSTT1, car le CDNB n’est pas un substrat pour ce sous-type. 36, 37 ans Pendant ce temps, le protocole peut être légèrement modifié pour contrer ce problème. Par exemple, en utilisant 1,2-époxy-3-(4′-nitrophenoxy)propane (ENPP) comme substrat pour GSTT1 et mesurer la quantité de conjugué à 360nm au lieu de 340nm. 37

Les étapes du protocole peuvent être adaptées et appliquées pour tester l’activité de la TPS et les tests inhibiteurs dans les expériences de culture cellulaire. La mesure de l’activité de la TPS sur les cellules traitées avec et sans inhibiteur de la TPS indiquera si ce composé peut être utilisé dans un tel contexte expérimental. Il est particulièrement intéressant lorsque l’inhibiteur est lipophile. Par exemple, nous avons présenté que la curcumine est un puissant inhibiteur de la TPS qui utilise ce protocole. Néanmoins, son application aux études cellulaires peut être limitée, car la molécule est mal soluble dans l’eau et se dégrade rapidement en milieu. 31 Une autre amélioration de ce protocole est possible en ce qui concerne la spécificité non isoforme du substrat CDNB. L’utilisation de ce protocole dans les études cellulaires ne donnera que de l’information sur l’ensemble de l’activité de la TPS, mais pas sur l’activité d’un sous-type précis de TPS. L’ajout d’un substrat spécifique à l’isoforme isoforme spécifique à l’isoforme de la TPS et/ou à l’aide d’un isoforme de TPS recombinant spécifique permettra de tester des inhibiteurs spécifiques de la TPS.

Pour conclure, nous décrivons une procédure complète pour tester les inhibiteurs de la TPS qui ont le potentiel d’être utilisés en combinaison avec la chimiothérapie électrophilique. Nous avons mis l’accent sur les étapes cruciales d’une enzyme de LA TPS et un test d’inhibition, pour tester les molécules intéressantes potentielles et déterminer leur efficacité en tant qu’inhibiteur avec des valeurs quantitatives, l’IC50 et le Ki. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel composé putatif et effectuée sur les isoformes humains de TPS les plus exprimés (GSTA1, GSTM1 et GSTP1), ou légèrement adaptée pour effectuer des études de culture cellulaire avec des inhibiteurs de la TPS ou mesurer l’activité d’autres isoformes de choix intéressants de la GST.

Réactifs Nom Concentration dans la solution d’essai Autres
Substrat CDNB Km mesuré (mM) Dilué dans 95% d’éthanol. La concentration finale d’éthanol devrait être ≤ 5 % (v/v)
Substrat de conjugaison Ba 2,5 mM Dilué dans l’eau.
La concentration doit saturer la solution.
Tampon Pbs – pH = 7,1
Enzyme Pool d’isoformes de TPS ou d’isoforme pure 0,01 unité/mL, déterminé expérimentalement. Dilué dans l’eau.
Inhibiteur de la TPS Composé potentiel de choix IC50: 3 concentrations qui inhibent au maximum, 3 qui inhibent au minimum, et 3 entre les deux. Dilué dans DMSO, puis dans l’eau, pour avoir une concentration finale de DMSO ≤ 1% (v/v)
Ki: 3 concentrations autour de l’IC50.
Paramètres
Température ambiante (25°C)
pH = 7,1
DMSO ≤ 1% (v/v)
Éthanol ≤ 5% (v/v)

Tableau 1 : Résumé des réactifs et des paramètres à prendre en considération lors d’un test d’inhibition de la TPS.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail de recherche a été soutenu par la Fondation CANSEARCH. Les auteurs tiennent à remercier Mme Laurence Lesne et M. Yoann Sarmiento pour leur assistance technique, en particulier dans la réalisation des expériences de reproduction tout en standardisant les tests avec des inhibiteurs. Les discussions fructueuses et les commentaires de M. Denis Marino, simona Mlakar et du Dr Vid Mlakar sont très reconnus. Nous remercions la Dre Patricia Huezo-Diaz Curtis pour son aide à la narration de la vidéo. Nous remercions le Dr Muthukumar pour ses contributions sur les prédictions en silico. Nous remercions également M. Darren Hart pour son aide à la lecture de ce manuscrit par la preuve en anglais.

Materials

1-Chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) Sigma-Aldrich 237329 Substrate used for the GST enzymatic assay
Corning UV-Transparent Microplates Sigma-Aldrich CLS3635 Transparent plate to perform the enzymatic assay.
When using 200 ul, the pathlength is 0.552 cm for this plate.
Curcumin Sigma-Aldrich 8511 Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 To prepare the stock of the putative inhibitor
DPBS Sigma-Aldrich D8537 Buffer for the enzymatic reaction
Ethanol 95% Fisher scientific 10542382 To dilute the CDNB
Glutathione S-Transferase from equine liver Sigma-Aldrich G6511 Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin
L-glutathione reduced (GSH) Sigma-Aldrich G4251 Co-substrate for the GST enzymatic assay
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23225 To quantify the amount of protein present in the enzymatic solution
Spectramax iD3 Molecular devices To do spectrophotometric measurments
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Robin, S. K. D., Ansari, M., Uppugunduri, C. R. S. Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases. J. Vis. Exp. (164), e61347, doi:10.3791/61347 (2020).
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