JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Sitosolion Glutatyon S-Transferazlarının Potansiyel Inhibitörleri için Spektrofotometrik Tarama

Published: October 10, 2020
doi:
10.3791/61347
, ,
1Research platform of Pediatric Onco-Hematology, Department of Paediatrics, Gynaecology and Obstetrics, Faculty of Medicine,University of Geneva, 2Section of Biology, Faculty of Science,University of Geneva, 3Onco-Hematology Unit, Department of Women, Children-Adolescents,University Hospitals of Geneva

Summary

Glutatyon S-transferazlar (GSTs) çok sayıda kemoterapötik ilaçların metabolizmasında rol oynayan detoksifikasyon enzimleridir. GST’lerin aşırı ekspresyonu kanser kemoterapi direnci ile ilişkilidir. Bu fenotip karşı bir yolu inhibitörleri kullanmaktır. Bu protokol, potansiyel GST inhibitörlerini taramak için spektrofotometrik bir test kullanarak bir yöntem tanımlar.

Abstract

Glutatyon S-transferazlar (GSTs) glutatyon (GSH) konjugasyonu ile endojen veya eksojen elektrofilik bileşiklerin ortadan kaldırılmasından sorumlu metabolik enzimlerdir. Buna ek olarak, GST’ler apoptotik yollarda yer alan mitojen aktive protein kinazlarının (MAPKs) düzenleyicileridir. GST’lerin aşırı ekspresyonu, elektrofilik alkilleyici ajanlarla kemoterapi gören hastalarda azalmış terapötik etkinlik ile ilişkilidir. GST inhibitörleri kullanarak bu eğilimi tersine çevirmek ve tedavi gücünü artırmak için potansiyel bir çözüm olabilir. Bu hedefe ulaşmak, doğru, hızlı ve kolay bir enzim tsay ile, bu tür bileşiklerin keşfi gerektirir. 1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) substrat olarak kullanılan bir spektrofotometrik protokol literatürde en çok kullanılan yöntemdir. Ancak, zaten açıklanan GST inhibisyonu deneyleri, CDNB için Michaelis-Menten sabitinin (Km)ölçümü veya kullanılan enzim konsantrasyonunun göstergesi, test edilmiş bir bileşiğin inhibisyon gücünü değerlendirmek için önemli parametreler gibi optimal inhibisyon testinin her aşamasını ayrıntılı olarak açıklayan bir protokol sağlamaz. Bu nedenle, bu protokol ile, potansiyel inhibitörlerin kitaplıklarını taramak için optimize edilmiş spektrofotometrik GST enzim testinin her adımını tanımlıyoruz. Hem yarı maksimal inhibitör konsantrasyonunun (IC50) hem de inhibisyon sabitinin (Ki)—bir enzim inhibitörünün gücünü ölçmek için kullanılan iki özelliğin hesaplanmasını açıklarız. Açıklanan yöntem, hücrelerden veya saf rekombinant insan GST’lerinden, yani GST alfa 1 (GSTA1), GST mu 1 (GSTM1) veya GST pi 1 ‘den (GSTP1) çıkarılan GST’ler havuzu kullanılarak uygulanabilir. Ancak, CDNB bu izoform için bir substrat olmadığı için bu protokol GST teta 1 (GSTT1) uygulanamaz. Bu yöntem, at karaciğerinden GST kullanarak curcumin inhibisyonu potens test etmek için kullanılmıştır. Curcumin anti-kanser özellikleri sergileyen bir moleküldür ve silico yerleştirme tahminleri sonra GST izoformlar doğru yakınlık gösterdi. Biz curcumin güçlü bir rekabetçi GST inhibitörü olduğunu gösterdi, 31.6 ± 3.6 μM bir IC50 ve Ki 23.2 ± 3.2 μM. Curcumin etkinliğini artırmak için elektrofilik kemoterapi ilaç ile kombine edilme potansiyeline sahiptir.

Introduction

Sitosolik glutatyon S-transferaz enzimleri (GSTs, EC 2.5.1.18) kemoterapötik ajanlar gibi çeşitli elektrofilik bileşikler içine glutatyon (GSH) konjugasyon katalize, detoks ve vücuttan kolayca ortadan kaldırmakiçin 1. Sitosolik GST’nin yedi isoformu alfa, mu, pi, sigma, omega, teta ve zeta olarak tanımlanmıştır. GST’ler esas olarak karaciğer, testisler, akciğerler ve gastrointestinal sistemde ifade edilir2. GST alfa 1 (GSTA1) isoform yüksek hepatositler ifade edilir. Vücut heterojen diğer alt tipleri ifade eder, GST pi dahil 1 (GSTP1) ağırlıklı olarak beyin, kalp, ve akciğerler, ve GST mu 1 (GSTM1) karaciğer vetestisler 3. GST isoforms arasında yüksek sekans homoloji olmasına rağmen, her sergiler substrat özgüllük ve farklı şekillerde ilaç metabolizması ve kanser karıştığı, diferansiyel ifadeye göre4,5.

Elektrofilik bileşikler ya vücuda dışa dönük olarak girer ya da endojen olarak üretilir. Pestisitler, prostaglandinler, kanserojenler ve kemoterapötik ilaçlar glutatyon konjugasyon reaksiyonları için potansiyel substratlar bazılarıdır6. Örneğin, bir hücre içinde oluşan herhangi bir elektron eksikliği reaktif bileşik elektrofilik substrat olma olasılığı yüksektir. Klorambucil veya melfalan gibi alkilleyici ajanlar GST’ler tarafından katalize GSH konjugatları olarak ortadan kaldırılır ve bu enzimlerin artan düzeyleri bu bileşiklere direnç ile korelasyon olmuştur6,7.

Sitosolik GST’lerin bir diğer önemli rolü de MAPK8 (c-Jun N-terminal kinaz veya JNK1 olarak da bilinir) ve MAP3K5 (apoptoz sinyal düzenleyici kinaz 1 veya ASK1olarakda bilinir) 8 gibi mitojen aktive protein kinazlarının (MAPK) aktivitesini düzenlemektir. Monomerik konformasyonlarındaki bazı izoformlar bu proteinlere bağlanır ve böylece fosforiyasyon basamaklarını bloke ederler. Normal şartlar altında, GSTP1 izoform MAPK8 (c-Jun proteinaktivatörü) tecrit edecek. C-Fos proteini ile c-Jun birleştirerek aktivatör protein 1 oluşturur (AP-1) transkripsiyon faktörü, pro-apoptotik genlerin transkripsiyonu sorumludur. Stresli hücrelerde, GSTP1 ve MAPK8 dissociates tarafından oluşturulan kompleks, c-Jun aktive edilir, ve apoptosis giden genler ifade etmeye başlar9. Bu GST isoform daha fazla ifade bu nedenle yolu bloke edebilir, artan hücre canlılığı yol, daha fazla hücresel prolifelife, ve kemoterapi için daha düşük hücresel duyarlılık. Benzer senaryolar GSTP1 paralogları ile oluşabilir, örneğin, GSTM1, MAP3K510ile etkileşim .

İlaç metabolizmasında ve MAPKs’nin sekestrasyonunda GST’lerin oynadığıroller,GST’lerin daha büyük bir ekspresyonunun kemoterapötik tedaviye karşı tümöral direnç mekanizmasının bir işareti olabileceği hipotezine yol açtı6,11. Örneğin, GSTP1 çok sayıda kanserde aşırı ifade edilir ve varlığı kötü bir prognoz ve nüks artan insidansı ile ilişkili olmuştur8. Bu genlerdeki polimorfizm, çeşitli hastalıklar sunan hastalarda diferansiyel ilaç maruziyeti ve sağkalım oranları göstererek, bu enzimlerin ilaç direnci mekanizmaları için çok önemli olduğu fikrini güçlendirmiştir. Örneğin, GSTM1 null genotip olan bireyler daha düşük ilaç temizleme ve daha iyi sağkalım ile ilişkilidir12,13. GSH analoglarının kullanımı, GST’lerle çekim le aktive edilen proilaçlar veya doğrudan GST inhibitörleri14,15gibi bu aşırı ifadeye karşı koymanın çeşitli potansiyel araçları vardır.

Tüm bu yöntemler şu anda araştırılmaktadır ve birkaç bileşikler hastalar arasında potansiyel kullanım ları için klinik çalışmalara başlamıştır. Ancak, bilgimizin en iyi, klinik ortamlarda GST inhibitörleri olarak kullanılan hiçbir bileşikler vardır15. Gerçekten de, bazı izoformlar veya normal hücrelerde GSH tükenmesi için özgüllük eksikliği, hangi organ sistemlerinde reaktif oksijen türlerinin birikimine neden toksisite yol açabilir (ROS), gst inhibitörleri potansiyelini azaltmak dezavantajları sadece bazılarıdır14,15. Bu bileşiklerin vücut üzerinde diğer farmakodinamik etkileri uygulamak olabilir riski de onların kullanımını sınırlandırıyor. Etakinik asit, örneğin, laboratuvar ortamlarında en çok çalışılan GST inhibitörü, ancak öncelikle güçlü bir idrar söktürücü olarak kullanıldığından, bu özellik klinik ortamlarda diğer ilaçlarile birlikte kullanımını sınırlar. Curcumin başarıyla bir GST inhibitörü olarak taranır başka bir doğal bileşiktir. Bu molekül zerdeçal Curcuma longa türlerinden elde edilen bir polifenol eterdir. Bu tümör hücre hatları çeşitli tür apoptosis indükleyerek kansere karşı olası bir tedavi seçeneği olarak umut verici sonuçlar göstermiştir16,17. Bileşik tirozin kinaz18 veya GST yolu gibi çeşitli hücresel yolları düzenleyebilir. Saf proteinler ile yapılan çalışmalar GSTA1, GSTM1 ve GSTP119,,20üzerindeki inhibisyon gücünü göstermiştir. Ancak, çelişkili sonuçlar kanser hücrelerinde gözlendi, hücreler curcumin ile tedavi edildiğinde daha fazla hücre içi GST aktivitesi ölçüldü21. Bu nedenle, daha fazla hücresel deney planlamadan önce, herhangi bir putatif GST inhibitörü nün yarı maksimal inhibitör konsantrasyonu (IC50) ve inhibisyon sabitini (Ki)araştırmak önemlidir.

Tarama ve potansiyel yeni GST inhibitörleri test bu nedenle önemli klinik ilgi, ve bulunan herhangi bir yeni bileşik elektrofilik ilaçlar ile birlikte kullanım için güvenli ve verimli olmalıdır. İzoforma özgü inhibitörler üzerinde durulan araştırmalar, spesifik GST ekspresyonu örüntülerini sergileyen tümör dokularında GST inhibisyonunu sağlayarak etkili bir kombinasyon tedavisinin geliştirilmesine olanak sağlayabilir. Diferansiyel inhibisyon modları ile inhibitörleri bulma da ilgi olabilir. Örneğin, bir substrat olarak GSH kullanan rekabetçi bir inhibitör onun tükenmesine neden olabilir. Hücrelerde GSH konsantrasyonunun bu azalma nöronlarda oksidatif stres indüklemek için gösterilmiştir, apoptosis yol. Başka bir yaygın inhibisyon modu-rekabet dışı inhibisyon-substrat yüksek konsantrasyonlarda mevcut olsa bile geri alınamaz.

Enzimatik aktivite oranı Michaelis-Menten sabiti (Km)ve maksimum hız (Vmax)ile temsil edilir, bu da michaelis-Menten grafiği çizilerek belirlenebilir, reaksiyonun hızına karşı substrat konsantrasyonu23. Km, enzimatik aktif alanların yarısını işgal etmek için gereken substrat konsantrasyonudur, yani yüksek Bir Km daha az yakınlık temsil ederler. Vmax, tüm aktif alanlar substrat tarafından işgal edildiğinde ulaşılan reaksiyonun maksimum hızını temsil eder. Km yarım Vmaxeşittir. En yaygın üç engelleme modu vardır: rekabetçi, rekabetçi olmayan ve rekabet edemeyen. Rekabetçi inhibisyon durumunda, inhibitör enzimin aktif bölgesine bağlanır ve substrat ile rekabet eder. Bu nedenle, Vmax inhibitörü eklenmesinden sonra değişmez, ancak Km artar, daha fazla substrat inhibisyon karşı gerekli olduğu gibi. Rekabet ematür, ancak substrat enzimle kompleks oluşturduğunda ortaya çıkar. Bu durumda, inhibisyon düzeyi substrat ve enzim konsantrasyonuna bağlı olduğundan, inhibitör reaksiyona eklendiğinde Vmax ve Km azalır. İnhibisyonun son modu rekabetçi değildir ve diğer iki inhibisyon modelinin bir karışımıdır. Inhibitör enzimin substratBağlı olup olmadığını enzimin aktif bölgeye bağlanabilir. Burada Vmax inhibitörü ilavesi sonra azalır, ancak Km 24değişmez.

GST aktivitesini ölçen bir spektrofotometrik tspeca ilk olarak Habig ve ark. tarafından 1974 yılında 1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) kullanılarak reaksiyon22’ninsubstratı olarak geliştirilmiştir. GSH ve CDNB arasındaki çekim, 340 nm dalga boyunda maksimum ışık emiciliği sergileyen GS-DNB formunu oluşturur ve spektrofotometre ile kaydedilebilir. Aşağıda açıklanan tekniğin çoğu Habig ve ark., en iyi ayarlar ve inhibitör bir tahkikat için önemli optimizasyon noktaları hakkında bilgi de dahil olmak üzere türetilmiştir. Bu teknik, ister hesaplamalı tahminler kullanılarak ister literatür taraması ile rasyonel ilaç seçimi tarafından seçilsin, potansiyel GST inhibitörlerinin taranmasıiçin uygulanabilir. Protokolün yeni sentezlenen GST proteinlerine veya spesifik isoformlara nasıl uyarlanış edilebilenler de tartışılmıştır. Örneğin, klinik olarak ilgili polimorfizm veya tek nükleotid polimorfizm (SNP) sergileyen GST izoformlarının inhibitör gücünü test etmek, hastaya özel GST’leri hedefleyen bu protokol için potansiyel kullanım alanları olabilir.

Bu protokol, diğer fonksiyonel çalışmalardan önce potansiyel GST inhibitörlerinin in vitro olarak taranması için hızlı, uygulanabilir ve etkili bir yöntem sağlar. Enzimatik inhibitörün en sık ölçülen özelliklerini değerlendirmek için gereken adımlar tanımlanmıştır: enzimatik aktiviteyi yarı yarıya azaltmak için gerekli inhibitör konsantrasyonu olan inhibitör konsantrasyonu 50 (IC50); ve inhibitör ve enzim arasındaki dissosiyatasyonun denge sabitini temsil eden inhibisyon sabiti (Ki)bu iki molekül arasındaki yakınlığın karakteristik özelliğidir. Bu iki değer doğrusal olmayan regresyon ile ölçülür ve her inhibisyon moduna özgü denklemler kullanılarak, sırasıyla. Ayrıca,inhibitör23,25,26eklenmesinden sonra Vmax ve Km değişimini belirlemek için Michaelis-Menten çizimleri kullanarak, inhibisyon bu modelin değerlendirilmesi göstermek.

Protocol

1. GST enzim çözeltisinin hazırlanması NOT: Enzim çözeltisinin hazırlanması prosedürü enzimaktivitesi birimlerinin tsay’dan önce bilinip bilinmediğine bağlıdır. Enzimlerden biri, dakikada 1 μmol ürün sentezlemek için gereken enzim miktarıdır. Enzimatik aktivite birim/mL veya μmol/min/mL olarak temsil edilir ve enzimatik çözeltinin seyreltilmesine bağlıdır. Spesifik enzimatik aktivite ünite/mg veya μmol/min/mg’da temsil edilir ve sadece çözeltinin saflığına bağlıdır. Her ikisi de bu özellikleri aşağıda belirlenir. İzole edilmiş bir GST izoformunun enzimatik birimi bilinmiyorsa, her reaksiyon için enzimatik konsantrasyonları ayarlamak ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak için tahmin edilmelidir. Eğer, tsömedinde kullanılan GST enzimatik birimi biliniyorsa: GST enziminin taze stok çözeltisini suda 0,1 U/mL’de hazırlayın ve ardından adım 2 ile devam edin.NOT: Bu çözelti -20 °C’de birkaç ay veya -80 °C’de daha uzun süre saklanabilir, ancak donma/çözülme döngüsünden kaçınılmalıdır. Tsömdede kullanılan GST enzimatik birimi bilinmiyorsa: Bir bicinchoninic asit kullanarak enzim çözeltisinin protein konsantrasyonu ölçmek (BCA) protein testi, ya da başka bir kit. Protein çözeltisini 0.02 mg/mL nihai protein konsantrasyonuna seyreltin. 96 kuyulu bir plakaya enzim çözeltisinin 20 μL’sini, 20 μL’ini GSH 25 mM (molekül ağırlığı: 307,32 g/mol) ve 150 μL Dulbecco’nun fosfat tamponlu salinini (DPBS) ekleyin. Boş için, enzim çözeltisi yerine 20°L su ekleyin. Her kuyuya 10 μL CDNB 50 mM (molekül ağırlığı: 202,55 g/mol) substrat ekleyin. Spektrofotometrik mikroplaka okuyucuda, kuyuları 340 nm olarak okumak için parametreleri ayarlayın. Emiciliği her dakika 10 dakika ölçmeli olarak ölçülmesi tavsiye edilir. Plakayı mikroplaka okuyucuya takın ve 1.2.5 adımın ayarlarına göre okumaya başlayın. Enzimatik numuneler ve boş için dakika başına absorbance değişikliğini hesaplayın.NOT: X ekseninde y ekseni ve dakika lar üzerinde emicilik çizerek reaksiyonun doğrusal olduğunu doğrulayın. Reaksiyon doğrusal değilse ve bir platoya ulaşırsa, tüm substrat kullanılır ve reaksiyon çok hızlı dır. Böylece, stok çözeltisini iki oranında seyrelterek kuyuya eklenen enzim miktarını azaltın. Test örneklerinin emicilik okumalarını boş düzeltin. Bira-Lambert yasasını temsil eden denklem 1 ile, her dakika oluşan GS-DNB konsantrasyonu (μM) hesaplayın.Denklem 1:C’nin μM’deki substrat konsantrasyonu olduğu yerde, A340/dk dakikada absorbans değişimidir, 1.2.7’de ölçüldüğü gibi, ε CDNB eşlenik için 340 nm (0,0096 μM-1*cm-1) ve l kuyudaki ışık yolunun uzunluğudur (cm cinsinden). 200 μL enzimatik çözelti ile doldurulmuş 96 kuyuluk bir plaka için yol uzunluğu 0,55 cm civarındadır. Bu değer plaka modeline göre değişebilir ve üretici ile doğrulanmalıdır. Μmol/dk içinde bir kuyuda bulunan ürün miktarını belirlemek için, 1.-4 Adım 1.2.9’un sonuçlarını 4 x 10-4 mg’a bölerek kullanılan protein başına aktiviteyi normalleştirin. Sonuç birim/mg veya μmol/min/mg’daki spesifik enzimatik aktivitedir.NOT: Seyreltme adım 1.2.6’da değiştirildiyse, doğrusal olmayan bir reaksiyon nedeniyle protein miktarını buna göre ayarlayın. Enzimatik aktiviteyi bulmak için, 1.2.10 adımda bulunan spesifik enzimatik aktiviteyi 0.002 mg/mL ile çarparak sonuçları mg/mL’deki protein konsantrasyonuna ayarlayın. Bu birim/mL veya μmol/min/mL enzimatik aktivite verecektir.NOT: Enzimatik aktivitenin aksine, bu ölçü protein çözeltisinin seyreltilmesine bağlı olarak değişmez. Adım 1.2.10 ile aynı not ama protein konsantrasyonu için. GST enziminin suda 0,1 birim/mL’de stok çözeltisini hazırlayın ve ardından adım 2 ile devam edin.NOT: Bu çözelti -20 °C’de birkaç ay veya -80 °C’de daha uzun süre saklanabilir, ancak donma/çözülme döngüsünden kaçınılmalıdır. Enzimatik aktivitenin kontrolü, protein çözeltisinin bozulması olabileceğinden deneylerin uzun bir süre boyunca yapılması önerilir. 2. CDNB için GST isoformun Michaelis-Menten sabitinin ölçümü NOT: Yordam bir CDNB alt katmanı için açıklanmıştır, ancak GSH gibi diğer alt tabakalara uygulanabilir. CDNB’nin her konsantrasyonunun kendi boş ihtiyacı vardır, çünkü 340 nm’deki absorbans CDNB konsantrasyonuna göre artacaktır. Etanol (v/v) içinde 10 mM ile 100 mM arasında değişen altı farklı CDNB konsantrasyonu hazırlayın. 10 μL CDNB, 20 μL GST enzimi, 20 μL GSH 25 mM ve 150 μL DPBS ile ispon çözeltisini hazırlayın. Boş için, CDNB çözümü yerine, sadece 10 μL etanol ekleyin 95%. 10 μL CDNB, 20 μL su, 20 μL GSH 25 mM ve 150 μL DPBS ile her CDNB konsantrasyonu için bir boşluk hazırlayın. Bir mikroplaka okuyucu ile 10 dakika boyunca her dakika 340 nm emme kaydedin. Doğru diğer test kuyularının boşluğundan sonuçları çıkararak emiciliği boş düzeltin. Ölçülen değerlere göre, Denklem 2’yi kullanarak reaksiyonun hızını hesaplayın.Denklem 2:A340/dk’nın dakikada absorbance’da deneysel olarak belirlenen değişim olduğu durumlarda, Vtoplamı (toplam hacim) 0,2 mL, Venzimi (enzim hacmi) 0,02 mL ve εGS-DNB 340 nm (9,6 mM-1*cm-1)ile GS-DNB konjuge molar yok olma katsayısıdır. 96 kuyulu bir plakanın 200 μL kuyuda yol uzunluğu 0,55 cm ‘dir (plaka tipine bağlı olarak) ve yok olma katsayısı 5,3 mM-1’eeşittir. Hız μmol/mL/min veya mM/dk ile temsil edilebilir. Michaelis-Menten grafiğini yüzey konsantrasyonuna (x ekseninde) karşı hız (y ekseninde) ile çizin. Reaksiyonun maksimum hızını (Vmax)ve Michaelis-Menten sabitini (Km)tanımlayın (yani, Vmax’inyarısındaki substrat konsantrasyonu).NOT: GraphPad Prizma gibi yazılımlar kullanılarak, enzim kinetik eğrisi, Vmax ve Kmgibi Michaelis-Menten enzim kinetik parametrelerinin hesaplanmasında doğrusal olmayan bir regresyon kullanılarak takılabilir. CdNB stok çözeltisini hesaplanan Km’nin 20 katı etanolde (v/v) hazırlayın. 3. Potansiyel GST inhibitörü absorbe NOT: Bu adım, reaksiyonda kullanılan potansiyel GST inhibitörü ölçülen dalga boyunda absorbans ı artıran bir metabolit üretip üretmediğini araştırmak için yapılır. Bu varsa, kullanılan inhibitör miktarı sonuçları üzerinde bir etkiye sahip olacak ve belirli bir boşluk her konsantrasyon için hazırlanmalıdır. Inhibitörü gerekli konsantrasyonlara seyreltin.NOT: İnhibisyon testi sırasında test edilen en düşük, orta ve en yüksek konsantrasyonlarda olmak üzere üç farklı seyreltme hazırlayın. Kuyudaki maksimum DMSO konsantrasyonu %1’e eşit veya daha az olmalıdır (v/v). DMSO konsantrasyonunun test edilen etkisi laboratuarımızda test edildi ve %1’i GST aktivitesini önemli ölçüde değiştirmedi. 96 kuyulu bir plakada, potansiyel GST inhibitöründen 2 μL, GSH 25 mM’nin 20 000’i ve 168 μL DPBS ekleyin. Inhibitör numuneleri için kullanılan çözücünün eşit hacimlilerini ekleyerek, inhibitör olmadan uygun bir kontrol kullanın. Enzimatik reaksiyonu başlatmak için reaksiyonu 10 dakika kuluçkaya yatırın.NOT: Bu adım, farklı kuluçka süreleri test edilerek, alt tabakanın toplam tükenmesini önlerken reaksiyona başlamanın ikiz amaçlarıyla optimize edilebilir. Adım 2’de bulunan Km’de son konsantrasyonu elde etmek için her kuyuya 10 μL CDNB ekleyin. Plakayı birkaç saniye sallayın. Bir mikroplaka okuyucu ile 10 dakika boyunca her dakika 340 nm emme kaydedin. Dakikada emicilik değişimini hesaplayın. Hem boş reaksiyona hem de negatif kontrol reaksiyonuna kıyasla emicilikteki değişimi hiçbir inhibitörle doğrulayın. Önemli bir değişiklik varsa, sonuçları ayarlamak için her inhibitör konsantrasyonu için boş kullanın.NOT: Bu sonuç, reaksiyonun bileşenlerinin, GST enzimi olmayan, kendiliğinden reaksiyona girer ve 340 nm’de emiciliği artıran bir metabolit ürettiğini gösterir. Bu ek emiciliği düzeltmek için, her konsantrasyon için belirli bir boşluk ölçülmelidir. Emicilikte önemli bir değişiklik yoksa, tüm konsantrasyonlar için sadece GST inhibitörü seyreltme için kullanılan çözücüiçeren genel bir boşluk kullanın. 4. GST ve IC50 değerlendirmesinin inhibisyonu Potansiyel GST inhibitörü dokuz konsantrasyonları hazırlayın.NOT: Konsantrasyonlar sonuçlara göre uyarlanabilir. Amaç doğrusal olmayan regresyon eğrisinin alt ve üst platolarını tanımlamaktır. Bu adım hakkında daha fazla bilgi için tartışma bölümüne bakın. 25 mM’de 20 μL’lik GSH çözeltisini 148 μL DPBS ile seyrelterek istinat çözeltisini hazırlayın. Ses tayında kullanılan kuyu sayısına göre hacmi uyarla. Açık 96-iyi plaka, 190 μL son hacminde enzimatik reaksiyon hazırlamak. Bu adımlar için çok kanallı pipet kullanılması önerilir. Test kuyuları için enzim çözeltisinin 20 μL’sini, potansiyel GST inhibitörü çözeltisinin 2 μL’sini ve 168 μL’lik test çözeltisini ekleyin. Kontrol için enzim çözeltisinin 20°L’sini, GST inhibitörü için kullanılan dilüentin 2 000’ini ve 168 μL’lik asa çözeltisini ekleyin. Boş kuyular için 20°L su, 2 μL potansiyel GST inhibitörü ve 168 μL’lik bir adak çözeltisi ekleyin.NOT: GST inhibitörü 340 nm dalga boyunu emerse, test edilen her konsantrasyon için belirli bir boşluk hazırlanmalıdır. Boş dahil olmak üzere her kuyuya 20x Km’de 10 μL CDNB çözeltisi ekleyin. Bu adım için çok kanallı pipet kullanılması önerilir. Plakayı birkaç saniye sallayın. Mikroplaka okuyucu kullanarak emiciliği dakikada 340 nm olarak 10 dakika ölçün. Sonuçları iyi boşluklardan çıkararak emiciliği boş düzeltin. GST inhibitörü çözeltisi kullanılarak elde edilen değerleri, kontrolün dakikada emiciliği ile hiçbir inhibitörsüz olmadan bölerek sonuçları normalleştirin. Inhibitörün logaritmik konsantrasyonunun (x-ekseni) doğrusal olmayan regresyon grafiklerini GST aktivitesine (y-ekseni) karşı çizin ve böylece IC50’yi belirleyin.NOT: GraphPad Prism kontrol enzimatik aktivitenin% 50 gösterecektir konsantrasyon tahmin ederek doğrusal olmayan regresyon arsalar IC50 hesaplar. Tahmin alt ve üst platolar yanı sıra sigmoid grafik tarafından oluşturulan eğim eğrisi dayanmaktadır. 5. Kive inhibisyon türünün değerlendirilmesi Dört farklı CDNB konsantrasyonu hazırlayın: üç daha yüksek ve bir km daha önce bulunan eşit. Daha önce bulunan IC50’ye eşit veya altında üç farklı GST inhibitörü konsantrasyonu hazırlayın. 4.2 ila 4.7 adımlarında açıklandığı gibi inhibisyon tayini gerçekleştirin. Denklem 2’yikullanarak reaksiyonların hızını hesaplayın. Her inhibitör konsantrasyonu için Michaelis-Menten grafiklerini çizin ve her reaksiyonun Vmax ve Km’sini hesaplayın. Farklı konsantrasyonlarda Vmax ve Km değişikliklere göre, inhibisyon GST inhibitörü modunu değerlendirmek.NOT: Bu adım, sonuçlar ve tartışma bölümlerinde daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır. İnhibisyon moduna bağlı olarak, Ki.NOT: GraphPad Prizma’da, inhibisyonun doğasına göre Ki’yi hesaplamak için farklı denklemler kullanılacaktır. Kullanılan denklemler inhibitörün eklenmesinden sonra gözlenen Km ve Vmax dayanmaktadır ve kontrol Km ve Vmaxile karşılaştırıldığında .

Representative Results

Michaelis-Menten sabiti (Km)CDNB ile AT karaciğerinden GSTCurcumin yüksek dozlarda yenilmesinden sonra bile güvenli bir doğal bileşiktir27 antikanser özellikleri gösterdi16. Bu molekülün inhibitör potens insan rekombinant GSTs19,,20gösterilmiştir. Açıklanan protokolü kullanarak, kurkuminin GST aktivitesi üzerindeki etkisini at karaciğerinden gelen GST izoformları havuzunu kullanarak değerlendirdik. Tedarikçiye göre, bu protein karışımının özgül aktivitesi 25 U/mg’dır. 0.1 U/mL’lik bir stok çözeltisi, liyofilize toz un uygun miktarda su ile eritilerek hazırlanmıştır. Etakinik asit bu bileşik çalışmalarda en yaygın olarak kullanılan GST inhibitörü olduğu gibi pozitif kontrol olarak paralel olarak kullanılmıştır. GST aktivitesi testi nin ayarlanması ve inhibitörlerin test edilmesindeki adımlar Şekil 1’deözetlenmiştir. Km her enzim substrat reaksiyonu için tanımlanmalıdır, çünkü Km’ye eşdeğer substrat konsantrasyonu kullanılması inhibisyon modunun belirlenmesikonusunda önyargı sağlamaz28. Bu parametreyi ölçmek için 2,5 mM GSH sabit konsantrasyonu kullanılarak, 0,5 mM ile 5 mM arasında değişen altı farklı CDNB konsantrasyonu test edildi. Reaksiyonun son hacmi 96 kuyulu bir plakada 200 μL idi. CdNB ve GSH’nin spontan çekimi oluşabilir ve absorbasyonu artırabilir, çünkü test iyi olarak CDNB aynı konsantrasyonu kullanarak, her deney için belirli bir boşluk kullanılmıştır. Tahlil karışımına stok çözeltisinin 20 μL’lik kısmı eklenerek tüm reaksiyonlar için 0.01 birim/mL’lik son bir enzim konsantrasyonu kullanıldı. 340 nm’de emicilik 10 dakika boyunca her dakika kaydedildi. Reaksiyonun hızı (mM/dk cinsinden) Denklem 2kullanılarak hesaplanmıştır. Michaelis-Menten grafiği substrat konsantrasyonu (mM) hızına (μM/dk) karşıFigure 2çizildi ve reaksiyonun Km değeri hesaplandı. Deney, en az üç veri kümesi benzer sonuçlar gösterene kadar tekrarlandı. Atm karaciğerinden GST ile CDNB’nin K m’si 0.26 ± 0.08 mM olarak ölçüldü. Bu gstt grubu kullanılarak her inhibitör titret için 0,2 mM CDNB konsantrasyonu kullanıldı. 340 nm’de emilen bir metabolitin spontan oluşumu GSH ve CDNB ile tek başına inkübe edilmiş curcumin kullanılarak ölçüldü. Aynı boşluk her deneydeki her inhibitör konsantrasyonu için kullanıldı. GST’lerde Curcumin’in inhibitör gücüCurcumin’s inhibitör gücü yazılım (örneğin, AutoDock Vina sürüm 1.1.2) ile silico yerleştirme simülasyonu kullanılarak tahmin edildi. 29 Farklı GST isoformları (yani GSTA1, GSTM1 ve GSTP1) ve curcumin arasındaki serbest bağlama enerjisi tahmin edildi (veriler gösterilmedi). Daha sonra, inhibisyon sabiti Ki Denklemi 3kullanılarak hesaplandı . Denklem 3:∆G silico analizi kullanılarak bulunan serbest bağlayıcı enerji, R gaz sabiti 1.987 cal*K-1*mol-1, ve T deney sırasında sıcaklık, Kelvin bu durumda (298 K). AutoDock Vina tarafından döndürülen serbest bağlayıcı enerji sonuçlarına dayanarak, curcumin sırasıyla 78.1 μM, 78.1 μM ve 27.4 μMK değerleri ile insan GSTA1, GSTM1 ve GSTP1 güçlü bir GST inhibitörüdür. İlk inhibitör tahliller bu hesaplamalı Ki tahminleri kullanılarak yapıldı ve konsantrasyonlar gerekirse sonuçlara göre ayarlandı. İlk olarak, IC50 tahmin edildi. Bu özellik, bir enzimin reaksiyon oranını azaltan inhibitörükonsantrasyonudur. Bu nedenle enzim konsantrasyonu bağlıdır30. Inhibitörün dokuz son konsantrasyonu hazırlandı, 0.39 μM ile 100 μM arasında değişen ve her konsantrasyon bir öncekinin iki katıydı. Tahlil çözeltisi 20 μL GSH 2.5 mM, at karaciğerinden 0.01 U/mL finalinde 2 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 000 g/L ve 148 μL PBS’den oluşuyordu. Kontrol curcumin için kullanılan dilüent ile aynı çözeltiden oluşuyordu. Bu karışım enzim tsay başlatmak ve bu bileşik tampon çözeltileri kararsız olduğu gibi, gut çözeltisi kurkumin bozulmasını önlemek için 15 dakika kuluçka oldu31. Daha sonra, 0,2 mM CDNB’lik son konsantrasyon için her kuyuya 4 mM’lik 10 μL CDNB çözeltisi eklendi. 340 nm’deki absorbans, dakika başına absorbance’daki değişiklikleri hesaplamak için her dakika 10 dakika boyunca kaydedildi. IC50’yi hesaplamak için, kurkumin ile kuluçkaya yatan her örnek, aktivite yüzdesini vermek için kontrole normalleştirildi. Bu sonuçlar, inhibitörün logaritmik konsantrasyonunun inhibisyona karşı doğrusal olmayan regresyonu hesaplanarak çizim yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. At karaciğerinden GST’de kurkumin için bulunan IC50 31,6 ± 3,6 μM(Şekil 3A)idi. Aynı deney pozitif kontrol olarak etakrinik asit kullanılarak paralel olarak, 0.39 ile 100 μM arasında değişen konsantrasyonlar ile, kurkumin ile birlikte yapılmıştır. IC50’nin 6.6 ± 1.1 μM(Şekil 3B)olduğu bulunmuştur. Bir sonraki adım, curcumin’in bu transferler üzerindeki inhibisyon modunu değerlendirmekti. Dört farklı curcumin konsantrasyonu test edildi: 0, 7.5, 15 ve 30 μM, cdnb dört farklı konsantrasyonları ile birlikte: 0.2, 0.4, 1, ve 1.5 mM. Protokol önceki denemeyle aynıydı. Her koşulun hızı Denklem 2kullanılarak hesaplanmıştır. Her inhibitör konsantrasyonu için, substrat konsantrasyonuna (mM) karşı hız (μM/dk) ile bir eğri çizildi (Şekil 3C). Vmax ve Km GraphPad Prizma ile her arsa dayalı olarak belirlenmiştir. Potansiyel inhibitörün inhibisyon şekli bu iki parametredeki değişikliklere ve tahlillerin farklı durumuna göre değerlendirildi. 24 Vmax koşullar arasında önemli ölçüde değişmedi ama Km farklı inhibitör konsantrasyonları ile arttı, GSTs curcumin inhibisyonu rekabetçi. İnhibisyon Bu desen inhibitör enzimin aktif site için substrat ile rekabet oluşur. Rekabetçi bir inhibitörün Ki ölçmek için, GraphPad Copeland ve ark.32tarafından açıklandığı gibi Denklem 4 ve Denklem 5 kullanır.Denklem 4:Denklem 5:Km obs gözlenen Michaelis-Menten sabit, Km michaelis-Menten kontrolün sabiti, [I] inhibitör konsantrasyonu, Ki inhibisyon sabiti, Y hız ve X substrat konsantrasyonudur. Hesaplamalar, inhibisyon modunun değerlendirilmesi ile aynı deneylere dayanmaktadır. Ki at karaciğerinden GST curcumin inhibisyonu için tahmin 23.2 ± 3.2 μM oldu. Şekil 1: GST enzimatiği ve inhibisyonu tahlillerinin adımlarını açıklayan akış şeması. Yordam la ilgili ayrıntılar protokol bölümünde sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: GST enzim aktivitesinin Michaelis-Menten çizimi. Substrat CDNB artan konsantrasyonu at karaciğergst bir havuzdan GST aktivitesini belirlemek için GSH sabit konsantrasyonu (2.5 mM) ile kullanılmıştır. CDNB için Km değeri grafiğin eğrisine göre 0,08 mM ± 0,08 mM olarak belirlenmiştir. Çizimdeki her veri noktası, SD ile dört farklı deneysel çalıştırmanın ortalamasını temsil eder. Şekil 3: Kurkumin ve etakriyonik asitin GST enzim aktivitesi üzerine etkisi. (A-B) Aynı GST (0,01 U/mL), GSH (2,5 mM) ve CDNB (0,2 mM) son konsantrasyonları doğrusal olmayan bir regresyon ile at karaciğerinden GST için her iki bileşiğin IC50’sini hesaplamak için kurkumin(A)veya pozitif kontrol etakriyonik asit(B)konsantrasyonlarının artması kullanıldı. IC50, kurkumin için 31,6 ± 3,6 μM, etakrinik asit için 6,6 ± 1,1 μM olarak belirlendi. (C) Michaelis-Menten farklı konsantrasyonlarda curcumin, CDNB substrat değişen konsantrasyonlarda inhibisyon rekabetçi bir modu gösteren karşı test. İnhibitör süzgeci olmadan Vmax ve Km sırasıyla 132,7 ± 4,6 μM ve 0,5 ± 0,08 μM olarak ölçüldü. 30 μM curcumin ile, Vmax ve Km 130.4 ± 13.1 μM ve 1.08 ± 0.39 μM. Tüm grafiklerdeki veri noktaları(A-C)SD ile üç farklı deneysel çalıştırmanın aracını temsil eder.

Discussion

Spektrofotometrik GST enzim testinin her adımını açıklayan bir protokol salıyoruz, putatif inhibitörleri(Şekil 1, Tablo 1)taramak ve inhibitör gücünü ölçmek için. Ayrıca, tekrarlanabilir sonuçlar sağlayan doğru enzim tahlilleri için göz önünde bulundurulması gereken en önemli kriterleri de vurguladık. Açıklanan protokolün diğer kolorimetrik yöntemler veya kütle spektrometresi üzerinde en büyük avantajları, bu protokolün hızlı ve kolay gerçekleştirilebilir ve GST aktivitesinin kantitatif ölçümlerinin yanı sıra taranmış moleküllerin inhibisyonu cocitensi sa¤lanmasının sa¤lanmışolduğudur.

Bir enzim inhibitörünün en önemli iki Michaelis-Menten parametresini hesaplamanın yolunu sıyoruz: IC50 ve Ki. Güçlü bir inhibitör mümkün olan en düşük Ki ve IC50 uygulayacak, inhibitör ve enzim arasındaki yakınlık yüksek olduğunu belirten30. IC50 enzim konsantrasyonu ve deneme koşulları33bağlı olduğundan, farklı deneyler veya diğer deneme koşulları34kullanılarak elde inhibitörleri karşılaştırmak için bu değeri kullanmak zor olabilir. İnhibisyon sabiti Ki kullanarak potansiyel bileşiklerin inhibitör potens daha iyi bir göstergesidir. Ki, iki inhibitörü farklı inhibisyon modlarıyla karşılaştırmak için kullanılabilir, çünkü bu inhibitör ve enzim arasındaki yakınlığa bağlıdır. Ancak, inhibisyonun doğası hakkında net bir fikre sahip olmak için inhibitörün parametrelerinin her ikisini de belirlemeli30. Kurkuminlerin IC50 ve Ki’yi sırasıyla 3,6 μM ± ve 23,2 ± 3,2 μM olarak ölçtük ve bu bileşiğin güçlü bir GST inhibitörü olduğunu belirttik. Bu sonuçlar, farklı insan GST izoformları ve curcumin için 27,4 ila 78,1 μM arasında Ki değerleri tahmin silico tahminleri doğruladı.

Enzimaktivitesi veya reaksiyon oranı ve enzim miktarı
Yukarıda belirtildiği gibi, IC50 enzim konsantrasyonuna bağlıdır ve enzimaktivitesi bilinmeyen bir düzeyde bir deney yapmak yanlış sonuçlara yol açabilir33. Inhibitör aktiviteyi azaltabilecek diğer faktörleri kontrol etmek için, her yeni GST grubu için enzimatik aktiviteyi göz önünde bulundurmalı ve ölçmelisiniz. Örneğin, çok fazla donma/çözülme döngüsünden kaynaklanan enzimatik bir toplu iş parçasının bozulması etkinliği azaltabilir ve böylece deneme aynı koşullar altında çalıştırılsa bile daha düşük bir IC50’ye yol açabilir. Başka bir deyişle, 0.01 birim enzim kullanarak 1 birim kullanarak aynı sonuçları vermeyecektir. Çok fazla enzim kullanmak substratın hızlı tükenmesine yol açabilir ve reaksiyon doğrusal bir şekle sahip olmayacaktır. Bu parametre böylece kesin olmayan bir sonuca yol açabilir, çünkü uzun bir kuluçka süresinden sonra emicilikte herhangi bir değişiklik görülemez.

Km Değeri
Bir inhibitör tarafından sergilenen inhibisyon türünü değerlendirmek için en iyi koşulları sağlamak için, substrat konsantrasyonu Michaelis-Menten sabitine (Km)eşit veya altında olmalıdır. Km enzim28aktif sitelerin yarısını işgal etmek için gerekli substrat konsantrasyonu ile temsil edilir. Örneğin, daha yüksek substrat konsantrasyonu rekabetçi bir inhibitöre karşı koyabilirsiniz ve bu tür inhibisyon değerlendirmek bu tür bir ortamda zor olacaktır. Bu nedenle, bu metodolojideki en önemli adımlardan biri enzimin Km’sinin seçilen substrat için belirlenmesidir (burada CDNB). Bazı çalışmalarda, bu değer belirlenmemiştir ve bu inhibitör neden olduğu inhibisyon paterni hakkında yanlış sonuçlara yol açabilir, ve inhibisyon modu yanlış ise, Denklem inhibisyon desen dayanır gibi Ki yanlış hesaplanacaktır26,28. Farklı bir GST isoform test edilirse, bu değer bir çift enzim ve ligand için benzersiz olduğundan, Km değerinin yeni bir değerlendirmesi zorunludur. 0,26 ± 0,08 mM olarak tanımladığımız Km (0,2 mM) daha düşük CDNB konsantrasyonu kullanıldığından, GST’de curcumin inhibisyonunun öngörülen rekabet modu doğru olarak belirlenmiştir.

IC50
IC50’yi tahmin etmek için iyi bir sigmoidal eğri elde etmek hem alt hem de üst platoları bulmayı gerektirir. Alt plato maksimum inhibitör aktivitesi sağlayan bir inhibitör konsantrasyonları temsil eder. Bazı durumlarda, bir bileşik tam enzim inhibe olmayabilir, yüksek konsantrasyonlarda bile, çözünürlüğü gibi teknik sorunlar nedeniyle. Ancak, GraphPad Prism gibi araçlar oldukça doğru alt plato sığabilir. Üst plato enzimi inhibe etmek için yetersiz olan inhibitör konsantrasyonlarından oluşur ve bu nedenle aktivite maksimaldır. Her iki plato da IC50’nin yanı sıra aradaki konsantrasyonları belirlemek için çok önemlidir, eğrinin eğimini bulmak için-daha sonra IC50 sigmoideğri35şeklinden türetilebilir. Curcumin suda kötü çözünür, bu nedenle bu istiyatuar kullanılan maksimum konsantrasyon sınırlıdır, istiyatuar çözeltisinde yağış önlemek için. Böylece GST aktivitesini tam olarak engellemeyen daha az konsantre çözeltiler kullanılmıştır. Bu durum, alt platonun belirlenmesinde sorunlara yol açtı. Bu sorunu çözmek için, kurkumin için 31,6 ± 3,6 μM’lik ic50 sağlayan doğrusal olmayan regresyon grafiğine dayalı alt değerleri tahmin ettik(Şekil 3A). Etakrinik asit için, bu bileşik istihsal çözeltisinde çözünür ve IC50 6.6 ± 1.1 μM olarak ölçüldü olarak alt plato için değerleri tahmin etmek gerek yoktu.

Bu yöntem insanda en çok ifade edilen GST izoformlarına, yani GSTA1, GSTM1 veya GSTP1’e uygulanabilir. Ancak, CDNB bu alt tip için bir alt tabaka olmadığı için, bu protokol GSTT1 izoformaktivitesini ölçmek için uygun değildir. 36, 37 Bu arada, protokol bu sorunu karşı lamak için biraz değiştirilebilir. Örneğin, 1,2-epoksi-3-(4′-nitrophenoxy)propan (ENPP) GSTT1 için bir substrat olarak kullanarak ve 340nm yerine 360nm konjuge miktarını ölçmek. 37.000

Protokolün adımları, hücre kültürü deneylerinde GST aktivitesini ve inhibitör testini test etmek için uyarlanmış ve uygulanabilir. GST inhibitörü ile ve GST inhibitörü olmayan hücrelerde GST aktivitesinin ölçülmesi, bu bileşiğin bu tür deneysel ortamda kullanIlip kullanılamayacağı na işaret eder. Inhibitör lipophilic olduğunda özellikle ilginçtir. Örneğin, biz curcumin güçlü bir GST inhibitörü bu protokolü kullanarak olduğunu sundu. Yine de, hücresel çalışmalara uygulanması sınırlı olabilir, molekül suda kötü çözünür ve orta hızla bozulur gibi. 31 Bu protokolün bir başka iyileştirilmesi substrat CDNB non-isoform özgüllük ile ilgili mümkündür. Hücre çalışmalarında bu protokolü kullanarak sadece genel GST etkinliği hakkında bilgi verecektir, ancak kesin GST alt tipi etkinliği hakkında değil. İzoforma özgü substrat ve/veya spesifik rekombinant GST izoform kullanılarak izoform spesifik GST inhibitörlerinin test inoform olarak kullanılmasına izin verecektir.

Sonuç olarak, elektrofilik kemoterapi ile birlikte kullanılma potansiyeline sahip GST inhibitörlerini test etmek için tam bir prosedür uyguluyoruz. Biz potansiyel ilginç molekül test etmek ve kantitatif değerler, IC50 ve Kiile inhibitör olarak verimliliğini belirlemek için, bir GST enzim ve inhibisyon testi önemli adımları vurguladı . Bu yöntem herhangi bir putatif bileşik uygulanabilir ve en ifade edilen insan GST izoformları (GSTA1, GSTM1 ve GSTP1) üzerinde gerçekleştirilen veya biraz GST inhibitörleri ile hücre kültürü çalışmaları gerçekleştirmek veya seçim diğer ilginç GST izoform aktivitesini ölçmek için uyarlanmış.

Reaktif Adı Asa çözeltisinde konsantrasyon Diğer
Substrat CDNB Ölçülen Km (mM) %95 etanolle seyreltilmiş. Son etanol konsantrasyonu %5 ≤ olmalıdır (v/v)
Çekim substrat Gsh 2,5 mM Suda seyreltilmiş.
Konsantrasyon çözeltiyi doygunlaştırmalıdır.
Arabellek Pbs – pH = 7.1
Enzim GST isoformhavuzu veya saf isoform 0.01 birim/mL, deneysel olarak belirlenir. Suda seyreltilmiş.
GST inhibitörü Potansiyel tercih bileşiği IC50: En üst düzeyde inhibe 3 konsantrasyonu, en az inhibe 3, ve 3 arasında. DMSO’da ve daha sonra suda seyreltilmiş, dmso ≤% 1 (v/v) son konsantrasyonu için
Ki: IC50 çevresinde 3 konsantrasyon.
Parametre
Oda sıcaklığı (25°C)
pH = 7.1
DMSO ≤ %1 (v/v)
Etanol ≤ %5 (v/v)

Tablo 1: GST inhibisyonu sırasında göz önünde bulundurulması gereken reaktiflerin ve parametrelerin özeti.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma CANSEARCH Vakfı tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, bayan Laurence Lesne ve Bay Yoann Sarmiento’yu teknik yardım için kabul etmek isterler, özellikle de tahlilleri inhibitörlerle standartlaştırırken çoğaltma deneylerini yaparken. Sayın Denis Marino, Dr Simona Mlakar ve Dr Vid Mlakar tarafından verimli tartışmalar ve girdileri büyük ölçüde kabul edilmektedir. Dr.Patricia Huezo-Diaz Curtis’e videonun anlatımındaki yardımları için teşekkür ederiz. Biz silico tahminler onun girişleri için Dr Muthukumar teşekkür ederiz. Ayrıca Bay Darren Hart’a bu el yazmasının İngilizce dil kanıtı okumasındaki yardımları için teşekkür ederiz.

Materials

1-Chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) Sigma-Aldrich 237329 Substrate used for the GST enzymatic assay
Corning UV-Transparent Microplates Sigma-Aldrich CLS3635 Transparent plate to perform the enzymatic assay.
When using 200 ul, the pathlength is 0.552 cm for this plate.
Curcumin Sigma-Aldrich 8511 Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 To prepare the stock of the putative inhibitor
DPBS Sigma-Aldrich D8537 Buffer for the enzymatic reaction
Ethanol 95% Fisher scientific 10542382 To dilute the CDNB
Glutathione S-Transferase from equine liver Sigma-Aldrich G6511 Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin
L-glutathione reduced (GSH) Sigma-Aldrich G4251 Co-substrate for the GST enzymatic assay
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23225 To quantify the amount of protein present in the enzymatic solution
Spectramax iD3 Molecular devices To do spectrophotometric measurments
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mannervik, B., Danielson, U. H. Glutathione transferases–structure and catalytic activity. CRC Critical Reviews in Biochemistry. 23 (3), 283-337 (1988).
  2. Awasthi, Y. C., Sharma, R., Singhal, S. S. Human glutathione S-transferases. The International Journal of Biochemistry. 26 (3), 295-308 (1994).
  3. Rowe, J. D., Nieves, E., Listowsky, I. Subunit diversity and tissue distribution of human glutathione S-transferases: interpretations based on electrospray ionization-MS and peptide sequence-specific antisera. Biochemical Journal. 325, 481-486 (1997).
  4. Beckett, G. J., Hayes, J. D. Glutathione S-transferases: biomedical applications. Advances in Clinical Chemistry. 30, 281-380 (1993).
  5. Oakley, A. Glutathione transferases: a structural perspective. Drug Metabolism Reviews. 43 (2), 138-151 (2011).
  6. Townsend, D. M., Tew, K. D. The role of glutathione-S-transferase in anti-cancer drug resistance. Oncogene. 22 (47), 7369-7375 (2003).
  7. Tew, K. D. Glutathione-associated Enzymes in Anticancer Drug Resistance. Cancer Research. 54 (16), 4313-4320 (1994).
  8. Laborde, E. Glutathione transferases as mediators of signaling pathways involved in cell proliferation and cell death. Cell Death and Differentiation. 17 (9), 1373-1380 (2010).
  9. Adler, V., et al. Regulation of JNK signaling by GSTp. The EMBO Journal. 18 (5), 1321-1334 (1999).
  10. Cho, S. G., et al. Glutathione S-Transferase Mu Modulates the Stress-activated Signals by Suppressing Apoptosis Signal-regulating Kinase 1. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12749-12755 (2001).
  11. Hayes, J. D., Flanagan, J. U., Jowsey, I. R. Glutathione Transferases. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 45 (1), 51-88 (2005).
  12. Lo, H. W., Ali-Osman, F. Genetic polymorphism and function of glutathione S-transferases in tumor drug resistance. Current Opinion in Pharmacology. 7 (4), 367-374 (2007).
  13. Ansari, M., et al. Glutathione S-transferase gene variations influence BU pharmacokinetics and outcome of hematopoietic SCT in pediatric patients. Bone Marrow Transplantation. 48 (7), 939-946 (2013).
  14. Mahajan, S., Atkins, W. M. The chemistry and biology of inhibitors and pro-drugs targeted to glutathione S-transferases. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 62 (11), 1221-1233 (2005).
  15. Allocati, N., Masulli, M., Ilio, C. D., Federici, L. Glutathione transferases: substrates, inihibitors and pro-drugs in cancer and neurodegenerative diseases. Oncogenesis. 7 (1), 8 (2018).
  16. Aggarwal, B. B., Kumar, A., Bharti, A. C. Anticancer potential of curcumin: preclinical and clinical studies. Anticancer Research. 23 (1), 363-398 (2003).
  17. Han, S. S., Chung, S. T., Robertson, D. A., Ranjan, D., Bondada, S. Curcumin causes the growth arrest and apoptosis of B cell lymphoma by downregulation of egr-1, c-myc, bcl-XL, NF-kappa B, and p53. Clinical Immunology. 93 (2), 152-161 (1999).
  18. Golonko, A., Lewandowska, H., Świsłocka, R., Jasińska, U. T., Priebe, W., Lewandowski, W. Curcumin as tyrosine kinase inhibitor in cancer treatment. European Journal of Medicinal Chemistry. 181, 111512 (2019).
  19. Awasthi, S., et al. Curcumin-glutathione interactions and the role of human glutathione S-transferase P1-1. Chemico-Biological Interactions. 128 (1), 19-38 (2000).
  20. Appiah-Opong, R., Commandeur, J. N. M., Istyastono, E., Bogaards, J. J., Vermeulen, N. P. E. Inhibition of human glutathione S-transferases by curcumin and analogues. Xenobiotica; the Fate of Foreign Compounds in Biological Systems. 39 (4), 302-311 (2009).
  21. Dubey, V., Owusu-Apenten, R. Curcumin Restores Glutathione-S-Transferase Activity for LNCaP Prostate Cancer Cells. Pure and Applied Chemistry. 2, 61-72 (2014).
  22. Habig, W. H., Pabst, M. J., Jakoby, W. B. Glutathione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation. The Journal of Biological Chemistry. 249 (22), 7130-7139 (1974).
  23. Johnson, K. A., Goody, R. S. The Original Michaelis Constant: Translation of the 1913 Michaelis-Menten Paper. Biochemistry. 50 (39), 8264-8269 (2011).
  24. Ochs, R. S. Understanding Enzyme Inhibition. Journal of Chemical Education. 77 (11), 1453 (2000).
  25. Bisswanger, H. Enzyme assays. Perspectives in Science. 1 (1), 41-55 (2014).
  26. Acker, M. G., Auld, D. S. Considerations for the design and reporting of enzyme assays in high-throughput screening applications. Perspectives in Science. 1 (1), 56-73 (2014).
  27. Cheng, A. L., et al. . Anticancer Research. 21, 2895-2900 (2001).
  28. Yang, J., Copeland, R. A., Lai, Z. Defining Balanced Conditions for Inhibitor Screening Assays That Target Bisubstrate Enzymes. Journal of Biomolecular Screening. 14 (2), 111-120 (2009).
  29. Uppugunduri, C. R. S., Muthukumaran, J., Santos-Silva, T., Ansari, M. Identification of putative substrates and inhibitors for Glutathione S-transferases using computational methods. Zenodo. , (2017).
  30. Burlingham, B. T., Widlanski, T. S. An Intuitive Look at the Relationship of Ki and IC50: A More General Use for the Dixon Plot. Journal of Chemical Education. 80 (2), 214 (2003).
  31. Wang, Y. J., et al. Stability of curcumin in buffer solutions and characterization of its degradation products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 15 (12), 1867-1876 (1997).
  32. Copeland, R. A. Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. A guide for medicinal chemists and pharmacologists. Methods of Biochemical Analysis. 46, 1 (2005).
  33. Kalliokoski, T., Kramer, C., Vulpetti, A., Gedeck, P. Comparability of Mixed IC50 Data – A Statistical Analysis. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
  34. Brandt, R. B., Laux, J. E., Yates, S. W. Calculation of inhibitor Ki and inhibitor type from the concentration of inhibitor for 50% inhibition for Michaelis-Menten enzymes. Biochemical Medicine and Metabolic Biology. 37 (3), 344-349 (1987).
  35. Brooks, H. B., et al. Basics of Enzymatic Assays for HTS. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2012).
  36. Arakawa, S., et al. Evaluation of hepatic glutathione transferase Mu 1 and Theta 1 activities in humans and mice using genotype information. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 40 (3), 497-503 (2012).
  37. Sherratt, P. J., Pulford, D. J., Harrison, D. J., Green, T., Hayes, J. D. Evidence that human class Theta glutathione S-transferase T1-1 can catalyse the activation of dichloromethane, a liver and lung carcinogen in the mouse. Comparison of the tissue distribution of GST T1-1 with that of classes Alpha, Mu and Pi GST in human. The Biochemical Journal. 326 (3), 837-846 (1997).

Tags

Spectrophotometric ScreeningCytosolic Glutathione S-transferasesGST InhibitorsEnzymatic ActivityInhibitory ConcentrationMode Of InhibitionCDNBGSHPBS

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Robin, S. K. D., Ansari, M., Uppugunduri, C. R. S. Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases. J. Vis. Exp. (164), e61347, doi:10.3791/61347 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image