Ativação optogenética de caminhos diferentes em fatias cerebrais e modulação de respostas por anestésicos voláteis
Summary
As fatias cerebrais ex vivo podem ser usadas para estudar os efeitos de anestésicos voláteis em respostas evocadas a diferentes entradas. A optogenética é empregada para ativar independentemente os afferents thalamocortical e corticocortical ao neocórtex não primário, e as respostas sinápticas e de rede são moduladas com isoflurano.
Abstract
Anestésicos influenciam a consciência em parte através de suas ações em circuitos thalamocortical. No entanto, ainda não está claro até que ponto os anestésicos voláteis afetam componentes celulares e de rede distintos desses circuitos. As fatias cerebrais ex vivo fornecem um meio pelo qual os pesquisadores podem sondar componentes discretos de redes complexas e desembaraçar mecanismos potenciais subjacentes aos efeitos de anestésicos voláteis em respostas evocadas. Para isolar potenciais efeitos de células e efeitos de drogas específicas em fatias cerebrais, os pesquisadores devem ser capazes de ativar independentemente vias de fibras diferentes, identificar populações não sobrepostas de células e aplicar anestésicos voláteis ao tecido em solução aquosa. Neste protocolo, são descritos métodos para medir respostas optogeneticamente evocadas a dois caminhos independentes a diferentes para o neocórtex em fatias cerebrais ex vivo. Respostas extracelulares são registradas para avaliar a atividade da rede e gravações de grampos de remendo de células inteiras direcionadas são realizadas em interneurônios somatostatina e parvalbumin-positivos. Descreve-se a entrega de concentrações fisiologicamente relevantes de isoflurane através de fluido espinhal cerebral artificial para modular as respostas celulares e de rede.
Introduction
Anestésicos voláteis têm sido usados onipresentemente em uma variedade de ambientes clínicos e acadêmicos por mais de um século. Classes distintas de anestésicos têm alvos moleculares únicos, muitas vezes não sobrepostos 1,2,3, mas quase todos eles produzem inconsciência. Embora seus efeitos comportamentais sejam bastante previsíveis, os mecanismos pelos quais os anestésicos induzem a perda de consciência são amplamente desconhecidos. Os anestésicos podem, em última análise, influenciar tanto o nível quanto o conteúdo da consciência através de ações em circuitos corticotalâmicos, interrompendo a integração da informação em toda a hierarquia cortical 4,5,6,7,8,9. De forma mais ampla, a modulação de circuitos corticotalâmicos pode desempenhar um papel experimentalmente10 ou farmacologicamente11 estados alterados de consciência, e também pode ser implicada no sono12 e em distúrbios fisiodósiológicos da consciência13,14.
A esquiva dos mecanismos subjacentes à perda e ao retorno da consciência durante a anestesia pode ser atribuída parcialmente a ações não lineares e sinérgicas de anestésicos nos níveis celular, de rede e sistemas15. Isoflurane, por exemplo, suprime a atividade dentro das regiões cerebrais selecionadas 16,17,18, prejudica a conectividade entre regiões cerebrais distantes 19,20,21,22,23, e diminui as respostas sinápticas de forma específica da via24,25 . Quais efeitos dos anestésicos, do nível molecular ao dos sistemas, são necessários ou suficientes para efetuar a perda de consciência permanece incerto. Além das investigações clínicas substantivas da consciência utilizando técnicas não invasivas 19,20,26, é importante que os experimentalistas busquem desembaraçar as distintas interações celulares e de rede que subservem a experiência consciente.
Simplificando as interações complexas encontradas no cérebro intacto, as fatias cerebrais ex vivo permitem o estudo de componentes isolados dos sistemas dinâmicos do cérebro9. Uma preparação reduzida de fatias combina os benefícios de estruturas anatômicas relativamente intactas de circuitos neurais locais com a versatilidade de manipulações in vitro. No entanto, até recentemente, as restrições metodológicas têm impedido o estudo das propriedades sinápticas e de circuito de insumos de longo alcance em fatias cerebrais27,28; o caminho tortuoso dos tratos de fibra corticotalâmica tornou a ativação de vias independentes, mas impossíveis por estimulação elétrica.
Investigar os efeitos dos agentes anestésicos nas preparações de fatias cerebrais apresenta desafios adicionais. Sem um sistema respiratório e circulatório intacto, os agentes anestésicos devem ser aplicados no banho, e concentrações cuidadosamente combinadas com concentrações estimadas do local de efeito. Para muitos agentes anestésicos intravenosos, a lenta taxa de equilíbrio no tecido torna as investigações farmacológicas tradicionais laboriosas29,30. Investigar os efeitos de anestésicos voláteis de gás nas preparações ex vivo é mais tratável, mas também apresenta desafios. Estes incluem a conversão de doses de pressão parcial inaladas em concentrações aquosas, e a necessidade de um sistema de entrega modificado da droga para o tecido através de fluido espinhal cerebral artificial31.
Aqui, os métodos são descritos pelos quais os investigadores podem capitalizar as propriedades físico-químicas bem documentadas do anestésico volátil para entrega de drogas para fatias cerebrais ex vivo, ativar entradas específicas de caminhos e camadas para uma área cortical de interesse com alta resolução espacial, e realizar gravações simultâneas de laminar e registros de grampos direcionados de populações selecionadas de neurônios. Combinados, esses procedimentos permitem aos pesquisadores medir alterações induzidas por anestésicos voláteis em várias propriedades de resposta eletrofisiológica observável, do nível sináptico ao nível da rede local.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste manuscrito, é descrito um protocolo para avaliação de respostas intra e extracelulares a caminhos aferentes seletivamente ativados em fatias cerebrais ex vivo.
O uso de ferramentas optogenéticas e esquemas paralelos de gravação permite que os investigadores testem respostas de populações locais a diferentes insumos de regiões cerebrais distantes, enquanto registram simultaneamente de populações-alvo de interneurons. O uso da tecnologia optogenética permite que terminais de ax…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem bryan Krause pelo apoio técnico e orientação sobre este projeto.
Este trabalho foi apoiado pela International Anesthesia Research Society (IMRA to AR), National Institutes of Health (R01 GM109086 to MIB) e pelo Departamento de Anestesiologia, Faculdade de Medicina e Saúde Pública, Universidade de Wisconsin, Madison, WI, EUA.
Materials
| 2.5x broadfield objective lens | Olympus | MPLFLN2.5X | |
| 40x water immersion objective lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 95% O2/5% CO2 mixture | Airgas | Z02OX95R2003045 | |
| A16 probe | NeuroNexus | A16x1-2mm-100-177-A16 | 16-channel probe |
| AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP | Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core | ||
| Anesthetic gas monitor (POET II) | Criticare | 602-3A | |
| ATP, Magnesium Salt | Sigma Aldrich | A9187 | intracellular solution |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Laboratory | 007914 | Cre-dependent tdTomato mouse |
| B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J | The Jackson Laboratory | 008069 | PV-Cre mouse |
| Belly Dancer Shaker | Thomas Scientific | 1210H86-TS | for equilibration of sealed gas bags |
| Betadine solution | Generic brand | ||
| Bleach | Generic brand | for silver chloriding patch clamp electrode | |
| Bupivicaine | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Dot Scientific | DSC20010 | ACSF |
| Capillary glass (patch clamp recordings) | King Precision Glass, Inc. | KG-33 | Borosilicate, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Length: 90.0mm |
| Capillary glass (viral injections) | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | 3.5" |
| Control of junior micromanipulator | Luigs and Neumann | SM8 | for control of junior micromanipulator |
| Control of manipulators and shifting table | Luigs and Neumann | SM7 | for control of multichannel electrode and shifting table |
| Digidata 1440A + Clampex 10 | Molecular Devices | 1440A | Digitizer and software |
| E-3603 tubing | Fisher Scientific | 14171208 | for delivery of 95% O2/5% CO2 gas mixture to incubation chamber + application of pressure during patch clamping |
| EGTA | Dot Scientific | DSE57060 | intracellular solution |
| ERP-27 EEG Reference/Patch Panel | Neuralynx | Retired | |
| Filling needle | World Precision Instruments | 50821912 | for filling patch clamp pipettes |
| Filter cube for imaging EYFP | Olympus | U-MRFPHQ | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09801E | lay over slice template during preparation of tissue block |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | 2.5×2.5 Box filament |
| Gas dispersion tube | Sigma Aldrich | CLS3953312C | |
| Glass syringe (100 mL) | Sigma Aldrich | Z314390 | for filling gas-sealed bags |
| Gluconic Acid, Potassium Salt (K-gluconate) | Dot Scientific | DSG37020 | intracellular solution |
| Glucose | Dot Scientific | DSG32040 | ACSF |
| GTP, Sodium Salt | Sigma Aldrich | G8877 | intracellular solution |
| Headstage-probe adaptor | NeuroNexus | A16-OM16 | adaptor to connect 16-channel probe to headstage input |
| Hemostatic Forceps | VWR International | 76192-096 | |
| HEPES | Dot Scientific | DSH75030 | ACSF,intracellular solution |
| HS-16 Headstage | Neuralynx | Retired | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Isopropyl alcohol (70%) | VWR International | 101223-746 | |
| Junior micromanipulator | Luigs and Neumann | 210-100 000 0090-R | for manipulation of patch clamp electrode |
| LED Light Source Control Module | Mightex | BLS-PL02_US | optogenetic light source control |
| Lidocaine | |||
| Lynx-8 Amplifier | Neuralynx | Retired | |
| Lynx-8 Power Supply | Neuralynx | Retired | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Dot Scientific | DSM24300 | ACSF |
| mCherry, Texas Red filter cube | Chroma | 49008 | for imaging tdTomato fluorescent reporter |
| Meloxicam | |||
| Micropipette holder | Fisher Scientific | NC9044962 | |
| Microsyringe pump | World Precision Instruments | UMP3-4 | |
| Mineral oil | Generic brand | ||
| MultiClamp 700A | Molecular Devices/Axon Instruments | 700A | Amplifier |
| Nitrogen (for air table) | Airgas | NI200 | |
| Nylon mesh | Fisher Scientific | 501460083 | stretched over horseshoe of flattened platinum wire, slice rest on top of this during recordings |
| Nylon, cut from pantyhose | Generic brand | small piece to create slice platform in incubation chamber, single fibers to create platinum harp | |
| Ophthalmic ointment | Fisher Scientific | NC1697520 | |
| Pipette | Dot Scientific | 307 | For transferring tissue to rig |
| Platinum wire | VWR International | BT124000 | 2 cm, flattened, to make platinum harp |
| Polygon400 | Mightex | DSI-E-0470-0617-000 | optogenetic light delivery system, comes with PolyScan2 software |
| Potassium Chloride (KCl) | Dot Scientific | DSP41000 | ACSF |
| Potassium Phosphate (KH2PO4) | Dot Scientific | DSP41200 | ACSF |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sapphire blade (for vibratome) | VWR International | 100492-502 | |
| Scalpel blade | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-361445 | |
| Sealed gas bag | Fisher Scientific | 109236 | |
| Shifting table for microscope | Luigs and Neumann | 380FMU | |
| Sodium Bicarbonate (HCO3-) | Dot Scientific | DSS22060 | ACSF |
| Sodium Chloride (NaCl) | Dot Scientific | DSS23020 | ACSF, intracellular solution |
| Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre) | The Jackson Laboratory | 013044 | SOM-Cre mouse |
| Stereotaxic instrument | Kopf | Model 902 | Dual Small Animal |
| Super glue | Staples | 886833 | to fix tissue block to specimen stage during slice preparation |
| Surgical drill | RAM Products Inc. | DIGITALMICROTORQUE | Microtorque II |
| Syringe (1 mL) with LuerLock tip | Fisher Scientific | 309628 | for application of pressure during patch clamping |
| Syringe (1 mL) with slip tip | WW Grainger, Inc. | 19G384 | for filling patch clamp pipettes |
| Syringe Filters | VWR International | 66064-414 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | |
| Vibrating microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| Wypall towels | Fisher Scientific | 19-042-427 |
References
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