הפעלה אופטוגנטית של מסלולים אפרנטיים בפרוסות מוח וויסות תגובות על ידי הרדמה נדיפה
Summary
ניתן להשתמש בפרוסות מוח Ex vivo כדי לחקור את ההשפעות של חומרי הרדמה נדיפים על תגובות מעוררות לתשומות אפרינטיות. אופטוגנטיקה משמשת להפעלה עצמאית של אפרנטים תלמוקורטיים וקורטיקוקורטיקליים לניאוקורטקס שאינו ראשוני, ותגובות סינפטיות ורשתיות מווסתות עם איזופלורן.
Abstract
חומרי הרדמה משפיעים על התודעה בין השאר באמצעות פעולותיהם על מעגלים תלמוקורטיים. עם זאת, המידה שבה חומרי הרדמה נדיפים משפיעים על רכיבים סלולריים ורשתיים שונים של מעגלים אלה עדיין אינה ברורה. פרוסות מוח Ex vivo מספקות אמצעי שבאמצעותו חוקרים יכולים לחקור רכיבים בדידים של רשתות מורכבות ולנטרל מנגנונים פוטנציאליים העומדים בבסיס ההשפעות של חומרי הרדמה נדיפים על תגובות מעוררות. כדי לבודד השפעות פוטנציאליות של תרופות ספציפיות לסוג התאים ולמסלולם בפרוסות מוח, חוקרים חייבים להיות מסוגלים להפעיל באופן עצמאי מסלולי סיבים אפרינטיים, לזהות אוכלוסיות תאים שאינן חופפות ולהחיל חומרי הרדמה נדיפים על הרקמה בתמיסה מימית. בפרוטוקול זה מתוארות שיטות למדידת תגובות אופטוגניות המעוררות לשני מסלולים אפירניים בלתי תלויים לניאוקורטקס בפרוסות המוח ex vivo. תגובות חוץ-תאיות נרשמות כדי לבחון את פעילות הרשת, והקלטות ממוקדות של מהדקי טלאים של תאים שלמים מתבצעות באינטרנורונים חיוביים לסומטוסטטין ופרוולבומין. מתוארת אספקה של ריכוזים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית של איזופלוראן דרך נוזל השדרה המוחי המלאכותי כדי לווסת את תגובות התאים והרשת.
Introduction
חומרי הרדמה נדיפים נמצאים בשימוש בכל מקום במגוון מסגרות קליניות ואקדמיות במשך יותר ממאה שנה. לסוגים שונים של חומרי הרדמה יש מטרות מולקולריות ייחודיות, לעתים קרובות לא חופפות 1,2,3, אך כמעט כולן מייצרות חוסר הכרה. בעוד שההשפעות ההתנהגותיות שלהם צפויות למדי, המנגנונים שבאמצעותם חומרי הרדמה גורמים לאובדן הכרה אינם ידועים במידה רבה. הרדמה עשויה בסופו של דבר להשפיע הן על רמת התודעה והן על תכניה באמצעות פעולות על מעגלים קורטיקותלמיים, ולשבש את שילוב המידע לאורך ההיררכיה הקורטיקלית 4,5,6,7,8,9. באופן רחב יותר, אפנון של מעגלים קורטיקותלמיים עשוי למלא תפקיד בניסוי 10 אופרמקולוגית 11 מצבי תודעה משתנים, ועשוי להיות מעורב גם בשינה 12 ובהפרעות פתופיזיולוגיות של תודעה13,14.
את החמקמקות של המנגנונים העומדים בבסיס אובדן והחזרת ההכרה במהלך ההרדמה ניתן לייחס באופן חלקי לפעולות לא ליניאריות וסינרגטיות של חומרי הרדמה ברמה התאית, הרשת והמערכות15. איזופלוראן, למשל, מדכא פעילות באזורי המוח שנבחרו 16,17,18, פוגע בקישוריות בין אזורי מוח מרוחקים 19,20,21,22,23, ומפחית תגובות סינפטיות באופן ספציפי למסלול 24,25 . עדיין לא ברור אילו השפעות של חומרי הרדמה, מהרמה המולקולרית ועד לרמה המערכתית, הכרחיות או מספיקות כדי לגרום לאובדן הכרה. בנוסף למחקרים קליניים מהותיים של התודעה תוך שימוש בטכניקות לא פולשניות 19,20,26, חשוב שהנסיינים יבקשו לנטרל את האינטראקציות התאיות והרשתיות המובחנות המשרתות את החוויה המודעת.
על ידי פישוט האינטראקציות המורכבות שנמצאות במוח השלם, פרוסות המוח ex vivo מאפשרות לחקור מרכיבים מבודדים של המערכות הדינמיות של המוח9. הכנת פרוסה מופחתת משלבת את היתרונות של מבנים אנטומיים שלמים יחסית של מעגלים עצביים מקומיים עם הרבגוניות של מניפולציות במבחנה. עם זאת, עד לאחרונה, אילוצים מתודולוגיים מנעו את חקר התכונות הסינפטיות והמעגלים של קלטים ארוכי טווח בפרוסות מוח27,28; הנתיב המפותל של דרכי סיבים קורטיקותלמיים הפך את ההפעלה של מסלולים אפירניים עצמאיים לבלתי אפשרית על ידי גירוי חשמלי.
חקירת ההשפעות של חומרי הרדמה על תכשירי פרוסות המוח מציבה אתגרים נוספים. בהיעדר מערכת נשימה ומחזור דם תקינה, יש למרוח חומרי הרדמה באמבטיה, ולהתאים את הריכוזים בקפידה לריכוזי ההשפעה המשוערים באתר. עבור חומרי הרדמה תוך ורידיים רבים, קצב שיווי המשקל האיטי ברקמה הופך את החקירות הפרמקולוגיות המסורתיות למייגעותשל 29,30. חקירת ההשפעות של הרדמת גזים נדיפים בתכשירי ex vivo היא נוחה יותר, אך גם מציבה אתגרים. אלה כוללים המרת מינוני לחץ חלקי בשאיפה לריכוזים מימיים, ואת הצורך במערכת אספקה שונה של התרופה לרקמה באמצעות נוזל עמוד השדרה המוחי המלאכותי31.
כאן מתוארות שיטות שבאמצעותן חוקרים יכולים לנצל את התכונות הפיסיקוכימיות המתועדות היטב של איזופלורן ההרדמה הנדיף להעברת תרופות לפרוסות מוח ex vivo, להפעיל קלטים ספציפיים למסלול ולשכבה לאזור עניין בקליפת המוח עם רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה, ולבצע הקלטות למינריות בו-זמניות והקלטות מהדקי טלאים ממוקדות מאוכלוסיות נבחרות של נוירונים. יחד, נהלים אלה מאפשרים לחוקרים למדוד שינויים הנגרמים על ידי הרדמה נדיפה במספר תכונות תגובה אלקטרופיזיולוגיות נצפות, מרמת הסינפטית ועד לרמת הרשת המקומית.
Protocol
Representative Results
Discussion
בכתב יד זה מתואר פרוטוקול להערכת תגובות תוך-תאיות וחוץ-תאיות למסלולים אפרנטיים המופעלים באופן סלקטיבי בפרוסות מוח ex vivo.
השימוש בכלים אופטוגנטיים ובשיטות הקלטה מקבילות מאפשר לחוקרים לחקור תגובות של אוכלוסיות מקומיות לתשומות מאזורי מוח מרוחקים, תוך הקלטה בו-זמנית מאוכלוסי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לבריאן קראוזה על התמיכה הטכנית וההדרכה בפרויקט זה.
עבודה זו נתמכה על ידי החברה הבינלאומית לחקר הרדמה (IMRA to AR), המכונים הלאומיים לבריאות (R01 GM109086 ל- MIB), והמחלקה להרדמה, בית הספר לרפואה ובריאות הציבור, אוניברסיטת ויסקונסין, מדיסון, WI, ארה”ב.
Materials
| 2.5x broadfield objective lens | Olympus | MPLFLN2.5X | |
| 40x water immersion objective lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 95% O2/5% CO2 mixture | Airgas | Z02OX95R2003045 | |
| A16 probe | NeuroNexus | A16x1-2mm-100-177-A16 | 16-channel probe |
| AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP | Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core | ||
| Anesthetic gas monitor (POET II) | Criticare | 602-3A | |
| ATP, Magnesium Salt | Sigma Aldrich | A9187 | intracellular solution |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Laboratory | 007914 | Cre-dependent tdTomato mouse |
| B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J | The Jackson Laboratory | 008069 | PV-Cre mouse |
| Belly Dancer Shaker | Thomas Scientific | 1210H86-TS | for equilibration of sealed gas bags |
| Betadine solution | Generic brand | ||
| Bleach | Generic brand | for silver chloriding patch clamp electrode | |
| Bupivicaine | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Dot Scientific | DSC20010 | ACSF |
| Capillary glass (patch clamp recordings) | King Precision Glass, Inc. | KG-33 | Borosilicate, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Length: 90.0mm |
| Capillary glass (viral injections) | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | 3.5" |
| Control of junior micromanipulator | Luigs and Neumann | SM8 | for control of junior micromanipulator |
| Control of manipulators and shifting table | Luigs and Neumann | SM7 | for control of multichannel electrode and shifting table |
| Digidata 1440A + Clampex 10 | Molecular Devices | 1440A | Digitizer and software |
| E-3603 tubing | Fisher Scientific | 14171208 | for delivery of 95% O2/5% CO2 gas mixture to incubation chamber + application of pressure during patch clamping |
| EGTA | Dot Scientific | DSE57060 | intracellular solution |
| ERP-27 EEG Reference/Patch Panel | Neuralynx | Retired | |
| Filling needle | World Precision Instruments | 50821912 | for filling patch clamp pipettes |
| Filter cube for imaging EYFP | Olympus | U-MRFPHQ | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09801E | lay over slice template during preparation of tissue block |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | 2.5×2.5 Box filament |
| Gas dispersion tube | Sigma Aldrich | CLS3953312C | |
| Glass syringe (100 mL) | Sigma Aldrich | Z314390 | for filling gas-sealed bags |
| Gluconic Acid, Potassium Salt (K-gluconate) | Dot Scientific | DSG37020 | intracellular solution |
| Glucose | Dot Scientific | DSG32040 | ACSF |
| GTP, Sodium Salt | Sigma Aldrich | G8877 | intracellular solution |
| Headstage-probe adaptor | NeuroNexus | A16-OM16 | adaptor to connect 16-channel probe to headstage input |
| Hemostatic Forceps | VWR International | 76192-096 | |
| HEPES | Dot Scientific | DSH75030 | ACSF,intracellular solution |
| HS-16 Headstage | Neuralynx | Retired | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Isopropyl alcohol (70%) | VWR International | 101223-746 | |
| Junior micromanipulator | Luigs and Neumann | 210-100 000 0090-R | for manipulation of patch clamp electrode |
| LED Light Source Control Module | Mightex | BLS-PL02_US | optogenetic light source control |
| Lidocaine | |||
| Lynx-8 Amplifier | Neuralynx | Retired | |
| Lynx-8 Power Supply | Neuralynx | Retired | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Dot Scientific | DSM24300 | ACSF |
| mCherry, Texas Red filter cube | Chroma | 49008 | for imaging tdTomato fluorescent reporter |
| Meloxicam | |||
| Micropipette holder | Fisher Scientific | NC9044962 | |
| Microsyringe pump | World Precision Instruments | UMP3-4 | |
| Mineral oil | Generic brand | ||
| MultiClamp 700A | Molecular Devices/Axon Instruments | 700A | Amplifier |
| Nitrogen (for air table) | Airgas | NI200 | |
| Nylon mesh | Fisher Scientific | 501460083 | stretched over horseshoe of flattened platinum wire, slice rest on top of this during recordings |
| Nylon, cut from pantyhose | Generic brand | small piece to create slice platform in incubation chamber, single fibers to create platinum harp | |
| Ophthalmic ointment | Fisher Scientific | NC1697520 | |
| Pipette | Dot Scientific | 307 | For transferring tissue to rig |
| Platinum wire | VWR International | BT124000 | 2 cm, flattened, to make platinum harp |
| Polygon400 | Mightex | DSI-E-0470-0617-000 | optogenetic light delivery system, comes with PolyScan2 software |
| Potassium Chloride (KCl) | Dot Scientific | DSP41000 | ACSF |
| Potassium Phosphate (KH2PO4) | Dot Scientific | DSP41200 | ACSF |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sapphire blade (for vibratome) | VWR International | 100492-502 | |
| Scalpel blade | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-361445 | |
| Sealed gas bag | Fisher Scientific | 109236 | |
| Shifting table for microscope | Luigs and Neumann | 380FMU | |
| Sodium Bicarbonate (HCO3-) | Dot Scientific | DSS22060 | ACSF |
| Sodium Chloride (NaCl) | Dot Scientific | DSS23020 | ACSF, intracellular solution |
| Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre) | The Jackson Laboratory | 013044 | SOM-Cre mouse |
| Stereotaxic instrument | Kopf | Model 902 | Dual Small Animal |
| Super glue | Staples | 886833 | to fix tissue block to specimen stage during slice preparation |
| Surgical drill | RAM Products Inc. | DIGITALMICROTORQUE | Microtorque II |
| Syringe (1 mL) with LuerLock tip | Fisher Scientific | 309628 | for application of pressure during patch clamping |
| Syringe (1 mL) with slip tip | WW Grainger, Inc. | 19G384 | for filling patch clamp pipettes |
| Syringe Filters | VWR International | 66064-414 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | |
| Vibrating microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| Wypall towels | Fisher Scientific | 19-042-427 |
References
- Baumgart, J. P., et al. Isoflurane inhibits synaptic vesicle exocytosis through reduced Ca2+ influx, not Ca2+-exocytosis coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 112 (38), 11959-11964 (2015).
- Herring, B. E., Xie, Z., Marks, J., Fox, A. P. Isoflurane inhibits the neurotransmitter release machinery. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 1265-1273 (2009).
- Xie, Z., et al. Interaction of anesthetics with neurotransmitter release machinery proteins. Journal of Neurophysiology. 109 (3), 758-767 (2013).
- Crick, F., Koch, C. A framework for consciousness. Nature Neurosciences. 6 (2), 119-126 (2003).
- Koch, C., Massimini, M., Boly, M., Tononi, G. Neural correlates of consciousness: progress and problems. Nature Reviews Neurosciences. 17 (5), 307-321 (2016).
- Dehaene, S., Changeux, J. P. Experimental and theoretical approaches to conscious processing. Neuron. 70 (2), 200-227 (2011).
- Friston, K. A theory of cortical responses. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 360 (1456), 815-836 (2005).
- Mashour, G. A., Hudetz, A. G. Bottom-Up and Top-Down Mechanisms of General Anesthetics Modulate Different Dimensions of Consciousness. Frontiers in Neural Circuits. 11, 44 (2017).
- Voss, L. J., Garcia, P. S., Hentschke, H., Banks, M. I. Understanding the Effects of General Anesthetics on Cortical Network Activity Using Ex Vivo Preparations. Anesthesiology. 130 (6), 1049-1063 (2019).
- Redinbaugh, M. J., et al. Thalamus Modulates Consciousness Via Layer-Specific Control of Cortex. Neuron. 105 (4), 0896 (2020).
- Carhart-Harris, R. L., Friston, K. J. REBUS and the Anarchic Brain: Toward a Unified Model of the Brain Action of Psychedelics. Pharmacological Reviews. 71 (3), 316-344 (2019).
- Mak-McCully, R. A., et al. Coordination of cortical and thalamic activity during non-REM sleep in humans. Nature communications. 8 (1), 15499 (2017).
- Alkire, M. T., Hudetz, A. G., Tononi, G. Consciousness and anesthesia. Science. 322 (5903), 876-880 (2008).
- Sanders, R. D., Maze, M. Noradrenergic trespass in anesthetic and sedative states. Anesthesiology. 117 (5), 945-947 (2012).
- Hemmings, H. C., et al. Towards a Comprehensive Understanding of Anesthetic Mechanisms of Action: A Decade of Discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 40 (7), 464-481 (2019).
- Nourski, K. V., et al. Auditory Predictive Coding across Awareness States under Anesthesia: An Intracranial Electrophysiology Study. Journal of Neurosciences. 38 (39), 8441-8452 (2018).
- Liu, X., et al. Propofol disrupts functional interactions between sensory and high-order processing of auditory verbal memory. Human Brain Mapping. 33 (10), 2487-2498 (2012).
- Hentschke, H., Raz, A., Krause, B. M., Murphy, C. A., Banks, M. I. Disruption of cortical network activity by the general anesthetic isoflurane. British Journal of Anaesthesiology. 119 (4), 685-696 (2017).
- Lee, U., et al. Disruption of frontal-parietal communication by ketamine, propofol, and sevoflurane. Anesthesiology. 118 (6), 1264-1275 (2013).
- Ferrarelli, F., et al. Breakdown in cortical effective connectivity during midazolam-induced loss of consciousness. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 107 (6), 2681-2686 (2010).
- Ku, S. W., Lee, U., Noh, G. J., Jun, I. G., Mashour, G. A. Preferential inhibition of frontal-to-parietal feedback connectivity is a neurophysiologic correlate of general anesthesia in surgical patients. PLoS.One. 6 (10), 25155 (2011).
- Lee, M., et al. Network Properties in Transitions of Consciousness during Propofol-induced Sedation. Scientific Reports. 7 (1), 16791 (2017).
- Murphy, M., et al. Propofol anesthesia and sleep: a high-density EEG study. Sleep. 34 (3), 283-291 (2011).
- Murphy, C., Krause, B., Banks, M. Selective effects of isoflurane on cortico-cortical feedback afferent responses in murine non-primary neocortex. British Journal of Anaesthesiology. 123 (4), 488-496 (2019).
- Raz, A., et al. Preferential effect of isoflurane on top-down versus bottom-up pathways in sensory cortex. Frontiers in System Neurosciences. 8, 191 (2014).
- Schrouff, J., et al. Brain functional integration decreases during propofol-induced loss of consciousness. Neuroimage. 57 (1), 198-205 (2011).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-Specific Feedforward Circuits between Thalamus and Neocortex Revealed by Selective Optical Stimulation of Axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gredell, J. A., Turnquist, P. A., MacIver, M. B., Pearce, R. A. Determination of diffusion and partition coefficients of propofol in rat brain tissue: implications for studies of drug action in vitro. BJA: British Journal of Anaesthesia. 93 (6), 810-817 (2004).
- Benkwitz, C., et al. Determination of the EC50 amnesic concentration of etomidate and its diffusion profile in brain tissue: implications for in vitro studies. Anesthesiology. 106 (1), 114-123 (2007).
- Franks, N. P., Lieb, W. R. Selective actions of volatile general anaesthetics at molecular and cellular levels. British Journal of Anaesthesia. 71 (1), 65-76 (1993).
- Honemann, C. W., Washington, J., Honemann, M. C., Nietgen, G. W., Durieux, M. E. Partition coefficients of volatile anesthetics in aqueous electrolyte solutions at various temperatures. Anesthesiology. 89 (4), 1032-1035 (1998).
- Au – Segev, A., Au – Garcia-Oscos, F., Au – Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Lin, J. Y. A user’s guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Experimental Physiology. 96 (1), 19-25 (2011).
- Banks, M. I., Pearce, R. A. Dual actions of volatile anesthetics on GABAA IPSCs: dissociation of blocking and prolonging effects. Anesthesiology. 90 (1), 120-134 (1999).
- Hagan, C. E., Pearce, R. A., Trudell, J. R., MacIver, M. B. Concentration measures of volatile anesthetics in the aqueous phase using calcium sensitive electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 81, 177-184 (1998).
