Activación optogenética de vías aferentes en cortes cerebrales y modulación de respuestas por anestésicos volátiles
Summary
Los cortes cerebrales ex vivo se pueden usar para estudiar los efectos de los anestésicos volátiles en las respuestas evocadas a las entradas aferentes. La optogenética se emplea para activar independientemente las aferentes talamocorticales y corticocorticales al neocórtex no primario, y las respuestas sinápticas y de red se modulan con isoflurano.
Abstract
Los anestésicos influyen en la conciencia en parte a través de sus acciones en los circuitos talamocorticales. Sin embargo, la medida en que los anestésicos volátiles afectan a distintos componentes celulares y de red de estos circuitos sigue sin estar clara. Los cortes cerebrales ex vivo proporcionan un medio por el cual los investigadores pueden sondear componentes discretos de redes complejas y desentrañar los posibles mecanismos subyacentes a los efectos de los anestésicos volátiles en las respuestas evocadas. Para aislar los posibles efectos específicos de los fármacos de tipo y vía celular en cortes cerebrales, los investigadores deben ser capaces de activar de forma independiente las vías de fibra aferente, identificar poblaciones de células no superpuestas y aplicar anestésicos volátiles al tejido en solución acuosa. En este protocolo, se describen métodos para medir las respuestas optogenéticamente evocadas a dos vías aferentes independientes al neocórtex en cortes cerebrales ex vivo. Las respuestas extracelulares se registran a la actividad de la red de ensayo y se realizan registros específicos de pinzas de parche de células enteras en interneuronas positivas para somatostatina y parvalbúmina. Se describe la administración de concentraciones fisiológicamente relevantes de isoflurano a través del líquido cefalorraquídeo artificial para modular las respuestas celulares y de red.
Introduction
Los anestésicos volátiles se han utilizado de manera ubicua en una variedad de entornos clínicos y académicos durante más de un siglo. Las distintas clases de anestésicostienen objetivos moleculares únicos, a menudo no superpuestos1,2,3, sin embargo, casi todos ellos producen inconsciencia. Si bien sus efectos conductuales son bastante predecibles, los mecanismos por los cuales los anestésicos inducen la pérdida de conciencia son en gran parte desconocidos. En última instancia, los anestésicos pueden influir tanto en el nivel como en el contenido de la conciencia a través de acciones en los circuitos corticotalámicos, interrumpiendo la integración de la información en toda la jerarquía cortical 4,5,6,7,8,9. En términos más generales, la modulación de los circuitos corticotalámicos puede desempeñar un papel en los estados alterados experimentalmente 10 o farmacológicamente 11 de la conciencia, y también puede estar implicada en el sueño12 y en los trastornos fisiopatológicos de la conciencia 13,14.
La elusividad de los mecanismos subyacentes a la pérdida y retorno de la conciencia durante la anestesia puede atribuirse parcialmente a las acciones sinérgicas no lineales de los anestésicos a nivel celular, de red y de sistemas15. El isoflurano, por ejemplo, suprime la actividad dentro de las regiones cerebrales seleccionadas 16,17,18, perjudica la conectividad entre regiones cerebrales distantes 19,20,21,22,23 y disminuye las respuestas sinápticas de una manera específica de la vía 24,25 . Aún no está claro qué efectos de los anestésicos, desde el nivel molecular hasta el de sistemas, son necesarios o suficientes para efectuar la pérdida de conciencia. Además de las investigaciones clínicas sustantivas de la conciencia utilizando técnicas no invasivas 19,20,26, es importante que los experimentalistas busquen desentrañar las distintas interacciones celulares y de red que sirven a la experiencia consciente.
Al simplificar las complejas interacciones encontradas en el cerebro intacto, los cortes cerebrales ex vivo permiten el estudio de componentes aislados de los sistemas dinámicos del cerebro9. Una preparación reducida combina los beneficios de las estructuras anatómicas relativamente intactas de los circuitos neuronales locales con la versatilidad de las manipulaciones in vitro. Sin embargo, hasta hace poco, las limitaciones metodológicas han impedido el estudio de las propiedades sinápticas y de circuito de las entradas de largo alcance en cortes cerebrales27,28; El tortuoso camino de los tractos de fibras corticotalámicas hizo que la activación de vías aferentes independientes fuera casi imposible mediante estimulación eléctrica.
La investigación de los efectos de los agentes anestésicos en las preparaciones de corte cerebral presenta desafíos adicionales. En ausencia de un sistema respiratorio y circulatorio intacto, los agentes anestésicos deben aplicarse en el baño y las concentraciones deben ajustarse cuidadosamente a las concentraciones estimadas del sitio del efecto. Para muchos agentes anestésicos intravenosos, la lenta tasa de equilibrio en el tejido hace que las investigaciones farmacológicas tradicionales sean laboriosas29,30. Investigar los efectos de los anestésicos de gases volátiles en preparaciones ex vivo es más manejable, pero también presenta desafíos. Estos incluyen la conversión de dosis de presión parcial inhalada a concentraciones acuosas, y la necesidad de un sistema de administración modificado del fármaco al tejido a través del líquido cefalorraquídeo artificial31.
Aquí, se describen métodos mediante los cuales los investigadores pueden capitalizar las propiedades fisicoquímicas bien documentadas del anestésico volátil isoflurano para la administración de fármacos a cortes cerebrales ex vivo, activar entradas específicas de vías y capas a un área cortical de interés con alta resolución espaciotemporal, y realizar registros laminares simultáneos y registros de pinzas de parche dirigidas de poblaciones seleccionadas de neuronas. Combinados, estos procedimientos permiten a los investigadores medir los cambios volátiles inducidos por la anestesia en varias propiedades observables de respuesta electrofisiológica, desde el nivel sináptico hasta el nivel de red local.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este manuscrito, se describe un protocolo para evaluar las respuestas intra y extracelulares a las vías aferentes activadas selectivamente en cortes cerebrales ex vivo.
El uso de herramientas optogenéticas y esquemas de registro paralelos permite a los investigadores sondear las respuestas de las poblaciones locales a las entradas aferentes de regiones cerebrales distantes, mientras registran simultáneamente de poblaciones específicas de interneuronas. El uso de la tecnología optogené…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Bryan Krause por el apoyo técnico y la orientación en este proyecto.
Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Internacional de Investigación de Anestesia (IMRA a AR), los Institutos Nacionales de Salud (R01 GM109086 a MIB) y el Departamento de Anestesiología, Escuela de Medicina y Salud Pública, Universidad de Wisconsin, Madison, WI, EUA.
Materials
| 2.5x broadfield objective lens | Olympus | MPLFLN2.5X | |
| 40x water immersion objective lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 95% O2/5% CO2 mixture | Airgas | Z02OX95R2003045 | |
| A16 probe | NeuroNexus | A16x1-2mm-100-177-A16 | 16-channel probe |
| AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP | Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core | ||
| Anesthetic gas monitor (POET II) | Criticare | 602-3A | |
| ATP, Magnesium Salt | Sigma Aldrich | A9187 | intracellular solution |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Laboratory | 007914 | Cre-dependent tdTomato mouse |
| B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J | The Jackson Laboratory | 008069 | PV-Cre mouse |
| Belly Dancer Shaker | Thomas Scientific | 1210H86-TS | for equilibration of sealed gas bags |
| Betadine solution | Generic brand | ||
| Bleach | Generic brand | for silver chloriding patch clamp electrode | |
| Bupivicaine | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Dot Scientific | DSC20010 | ACSF |
| Capillary glass (patch clamp recordings) | King Precision Glass, Inc. | KG-33 | Borosilicate, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Length: 90.0mm |
| Capillary glass (viral injections) | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | 3.5" |
| Control of junior micromanipulator | Luigs and Neumann | SM8 | for control of junior micromanipulator |
| Control of manipulators and shifting table | Luigs and Neumann | SM7 | for control of multichannel electrode and shifting table |
| Digidata 1440A + Clampex 10 | Molecular Devices | 1440A | Digitizer and software |
| E-3603 tubing | Fisher Scientific | 14171208 | for delivery of 95% O2/5% CO2 gas mixture to incubation chamber + application of pressure during patch clamping |
| EGTA | Dot Scientific | DSE57060 | intracellular solution |
| ERP-27 EEG Reference/Patch Panel | Neuralynx | Retired | |
| Filling needle | World Precision Instruments | 50821912 | for filling patch clamp pipettes |
| Filter cube for imaging EYFP | Olympus | U-MRFPHQ | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09801E | lay over slice template during preparation of tissue block |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | 2.5×2.5 Box filament |
| Gas dispersion tube | Sigma Aldrich | CLS3953312C | |
| Glass syringe (100 mL) | Sigma Aldrich | Z314390 | for filling gas-sealed bags |
| Gluconic Acid, Potassium Salt (K-gluconate) | Dot Scientific | DSG37020 | intracellular solution |
| Glucose | Dot Scientific | DSG32040 | ACSF |
| GTP, Sodium Salt | Sigma Aldrich | G8877 | intracellular solution |
| Headstage-probe adaptor | NeuroNexus | A16-OM16 | adaptor to connect 16-channel probe to headstage input |
| Hemostatic Forceps | VWR International | 76192-096 | |
| HEPES | Dot Scientific | DSH75030 | ACSF,intracellular solution |
| HS-16 Headstage | Neuralynx | Retired | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Isopropyl alcohol (70%) | VWR International | 101223-746 | |
| Junior micromanipulator | Luigs and Neumann | 210-100 000 0090-R | for manipulation of patch clamp electrode |
| LED Light Source Control Module | Mightex | BLS-PL02_US | optogenetic light source control |
| Lidocaine | |||
| Lynx-8 Amplifier | Neuralynx | Retired | |
| Lynx-8 Power Supply | Neuralynx | Retired | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Dot Scientific | DSM24300 | ACSF |
| mCherry, Texas Red filter cube | Chroma | 49008 | for imaging tdTomato fluorescent reporter |
| Meloxicam | |||
| Micropipette holder | Fisher Scientific | NC9044962 | |
| Microsyringe pump | World Precision Instruments | UMP3-4 | |
| Mineral oil | Generic brand | ||
| MultiClamp 700A | Molecular Devices/Axon Instruments | 700A | Amplifier |
| Nitrogen (for air table) | Airgas | NI200 | |
| Nylon mesh | Fisher Scientific | 501460083 | stretched over horseshoe of flattened platinum wire, slice rest on top of this during recordings |
| Nylon, cut from pantyhose | Generic brand | small piece to create slice platform in incubation chamber, single fibers to create platinum harp | |
| Ophthalmic ointment | Fisher Scientific | NC1697520 | |
| Pipette | Dot Scientific | 307 | For transferring tissue to rig |
| Platinum wire | VWR International | BT124000 | 2 cm, flattened, to make platinum harp |
| Polygon400 | Mightex | DSI-E-0470-0617-000 | optogenetic light delivery system, comes with PolyScan2 software |
| Potassium Chloride (KCl) | Dot Scientific | DSP41000 | ACSF |
| Potassium Phosphate (KH2PO4) | Dot Scientific | DSP41200 | ACSF |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sapphire blade (for vibratome) | VWR International | 100492-502 | |
| Scalpel blade | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-361445 | |
| Sealed gas bag | Fisher Scientific | 109236 | |
| Shifting table for microscope | Luigs and Neumann | 380FMU | |
| Sodium Bicarbonate (HCO3-) | Dot Scientific | DSS22060 | ACSF |
| Sodium Chloride (NaCl) | Dot Scientific | DSS23020 | ACSF, intracellular solution |
| Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre) | The Jackson Laboratory | 013044 | SOM-Cre mouse |
| Stereotaxic instrument | Kopf | Model 902 | Dual Small Animal |
| Super glue | Staples | 886833 | to fix tissue block to specimen stage during slice preparation |
| Surgical drill | RAM Products Inc. | DIGITALMICROTORQUE | Microtorque II |
| Syringe (1 mL) with LuerLock tip | Fisher Scientific | 309628 | for application of pressure during patch clamping |
| Syringe (1 mL) with slip tip | WW Grainger, Inc. | 19G384 | for filling patch clamp pipettes |
| Syringe Filters | VWR International | 66064-414 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | |
| Vibrating microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| Wypall towels | Fisher Scientific | 19-042-427 |
References
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