Activation optogénétique des voies afférentes dans les tranches de cerveau et modulation des réponses par des anesthésiques volatils
Summary
Les tranches de cerveau ex vivo peuvent être utilisées pour étudier les effets des anesthésiques volatils sur les réponses évoquées aux entrées afférentes. L’optogénétique est utilisée pour activer indépendamment les afférences thalamocorticales et corticocorticales au néocortex non primaire, et les réponses synaptiques et réseau sont modulées avec l’isoflurane.
Abstract
Les anesthésiques influencent la conscience en partie via leurs actions sur les circuits thalamocorticaux. Cependant, la mesure dans laquelle les anesthésiques volatils affectent les composants cellulaires et de réseau distincts de ces circuits reste incertaine. Les tranches de cerveau ex vivo fournissent un moyen par lequel les chercheurs peuvent sonder des composants discrets de réseaux complexes et démêler les mécanismes potentiels sous-jacents aux effets des anesthésiques volatils sur les réponses évoquées. Pour isoler les effets potentiels des médicaments spécifiques au type cellulaire et à la voie dans les tranches de cerveau, les chercheurs doivent être en mesure d’activer indépendamment les voies des fibres afférentes, d’identifier les populations de cellules qui ne se chevauchent pas et d’appliquer des anesthésiques volatils sur le tissu en solution aqueuse. Dans ce protocole, des méthodes pour mesurer les réponses évoquées optogénétiquement à deux voies afférentes indépendantes vers le néocortex dans des coupes de cerveau ex vivo sont décrites. Les réponses extracellulaires sont enregistrées à l’activité du réseau de dosage et des enregistrements ciblés de patch cellulaire entier sont effectués dans les interneurones positifs à la somatostatine et à la parvalbumine. L’administration de concentrations physiologiquement pertinentes d’isoflurane par le liquide céphalo-rachidien artificiel pour moduler les réponses cellulaires et de réseau est décrite.
Introduction
Les anesthésiques volatils sont utilisés partout dans divers milieux cliniques et universitaires depuis plus d’un siècle. Des classes distinctes d’anesthésiques ont des cibles moléculaires uniques, souvent sans chevauchement 1,2,3, mais presque toutes produisent une perte de conscience. Bien que leurs effets comportementaux soient assez prévisibles, les mécanismes par lesquels les anesthésiques induisent une perte de conscience sont largement inconnus. Les anesthésiques peuvent finalement influencer à la fois le niveau et le contenu de la conscience via des actions sur les circuits corticothalamiques, perturbant l’intégration de l’information dans toute la hiérarchie corticale 4,5,6,7,8,9. Plus largement, la modulation des circuits corticothalamiques peut jouer un rôle dans expérimentalement 10 ou pharmacologiquement 11 états altérés de conscience, et peut également être impliquée dans le sommeil12 et dans les troubles physiopathologiques de la conscience 13,14.
Le caractère insaisissable des mécanismes sous-jacents à la perte et au retour de conscience pendant l’anesthésie peut être attribué en partie aux actions synergiques non linéaires des anesthésiques aux niveaux cellulaire, du réseau et des systèmes15. L’isoflurane, par exemple, supprime l’activité dans les régions cérébrales sélectionnées 16,17,18, altère la connectivité entre les régions cérébrales distantes 19,20,21,22,23 et diminue les réponses synaptiques d’une manière spécifique à la voie 24,25 . Les effets des anesthésiques, du niveau moléculaire au niveau systémique, sont nécessaires ou suffisants pour provoquer une perte de conscience restent incertains. En plus des recherches cliniques substantielles de la conscience utilisant des techniques non invasives 19,20,26, il est important que les expérimentateurs cherchent à démêler les interactions cellulaires et de réseau distinctes qui sous-servent l’expérience consciente.
En simplifiant les interactions complexes trouvées dans le cerveau intact, les tranches de cerveau ex vivo permettent l’étude de composants isolés des systèmes dynamiques du cerveau9. Une préparation en tranches réduites combine les avantages des structures anatomiques relativement intactes des circuits neuronaux locaux avec la polyvalence des manipulations in vitro. Cependant, jusqu’à récemment, des contraintes méthodologiques ont empêché l’étude des propriétés synaptiques et des circuits des entrées à longue portée dans les tranches de cerveau27,28; Le chemin tortueux des voies fibreuses corticothalamiques rendait l’activation des voies afférentes indépendantes pratiquement impossible par stimulation électrique.
L’étude des effets des agents anesthésiques sur les préparations de tranches de cerveau présente des défis supplémentaires. En l’absence d’un système respiratoire et circulatoire intact, les agents anesthésiques doivent être appliqués au bain et les concentrations doivent être soigneusement adaptées aux concentrations estimées au site d’effet. Pour de nombreux anesthésiques intraveineux, la lenteur de l’équilibre dans le tissu rend les investigations pharmacologiques traditionnelles laborieuses29,30. L’étude des effets des anesthésiques gazeux volatils dans les préparations ex vivo est plus facile à traiter, mais présente également des défis. Il s’agit notamment de convertir les doses de pression partielle inhalées en concentrations aqueuses et de la nécessité d’un système d’administration modifié du médicament dans les tissus par le liquide céphalo-rachidien artificiel31.
Ici, des méthodes sont décrites par lesquelles les chercheurs peuvent capitaliser sur les propriétés physico-chimiques bien documentées de l’isoflurane anesthésique volatil pour l’administration de médicaments à des tranches de cerveau ex vivo, activer des entrées spécifiques à la voie et à la couche dans une zone d’intérêt corticale avec une résolution spatio-temporelle élevée, et effectuer simultanément des enregistrements laminaires et des enregistrements ciblés de pinces patch à partir de populations sélectionnées de neurones. Combinées, ces procédures permettent aux chercheurs de mesurer les changements volatils induits par l’anesthésique dans plusieurs propriétés de réponse électrophysiologique observables, du niveau synaptique au niveau du réseau local.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce manuscrit, un protocole d’évaluation des réponses intra- et extracellulaires aux voies afférentes activées sélectivement dans des tranches de cerveau ex vivo est décrit.
L’utilisation d’outils optogénétiques et de schémas d’enregistrement parallèles permet aux chercheurs de sonder les réponses des populations locales aux entrées afférentes provenant de régions cérébrales éloignées, tout en enregistrant simultanément des populations ciblées d’interneurones….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Bryan Krause pour son soutien technique et ses conseils sur ce projet.
Ce travail a été soutenu par l’International Anesthesia Research Society (IMRA à AR), les National Institutes of Health (R01 GM109086 à MIB) et le Département d’anesthésiologie, École de médecine et de santé publique, Université du Wisconsin, Madison, WI, États-Unis.
Materials
| 2.5x broadfield objective lens | Olympus | MPLFLN2.5X | |
| 40x water immersion objective lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 95% O2/5% CO2 mixture | Airgas | Z02OX95R2003045 | |
| A16 probe | NeuroNexus | A16x1-2mm-100-177-A16 | 16-channel probe |
| AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP | Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core | ||
| Anesthetic gas monitor (POET II) | Criticare | 602-3A | |
| ATP, Magnesium Salt | Sigma Aldrich | A9187 | intracellular solution |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Laboratory | 007914 | Cre-dependent tdTomato mouse |
| B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J | The Jackson Laboratory | 008069 | PV-Cre mouse |
| Belly Dancer Shaker | Thomas Scientific | 1210H86-TS | for equilibration of sealed gas bags |
| Betadine solution | Generic brand | ||
| Bleach | Generic brand | for silver chloriding patch clamp electrode | |
| Bupivicaine | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Dot Scientific | DSC20010 | ACSF |
| Capillary glass (patch clamp recordings) | King Precision Glass, Inc. | KG-33 | Borosilicate, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Length: 90.0mm |
| Capillary glass (viral injections) | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | 3.5" |
| Control of junior micromanipulator | Luigs and Neumann | SM8 | for control of junior micromanipulator |
| Control of manipulators and shifting table | Luigs and Neumann | SM7 | for control of multichannel electrode and shifting table |
| Digidata 1440A + Clampex 10 | Molecular Devices | 1440A | Digitizer and software |
| E-3603 tubing | Fisher Scientific | 14171208 | for delivery of 95% O2/5% CO2 gas mixture to incubation chamber + application of pressure during patch clamping |
| EGTA | Dot Scientific | DSE57060 | intracellular solution |
| ERP-27 EEG Reference/Patch Panel | Neuralynx | Retired | |
| Filling needle | World Precision Instruments | 50821912 | for filling patch clamp pipettes |
| Filter cube for imaging EYFP | Olympus | U-MRFPHQ | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09801E | lay over slice template during preparation of tissue block |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | 2.5×2.5 Box filament |
| Gas dispersion tube | Sigma Aldrich | CLS3953312C | |
| Glass syringe (100 mL) | Sigma Aldrich | Z314390 | for filling gas-sealed bags |
| Gluconic Acid, Potassium Salt (K-gluconate) | Dot Scientific | DSG37020 | intracellular solution |
| Glucose | Dot Scientific | DSG32040 | ACSF |
| GTP, Sodium Salt | Sigma Aldrich | G8877 | intracellular solution |
| Headstage-probe adaptor | NeuroNexus | A16-OM16 | adaptor to connect 16-channel probe to headstage input |
| Hemostatic Forceps | VWR International | 76192-096 | |
| HEPES | Dot Scientific | DSH75030 | ACSF,intracellular solution |
| HS-16 Headstage | Neuralynx | Retired | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Isopropyl alcohol (70%) | VWR International | 101223-746 | |
| Junior micromanipulator | Luigs and Neumann | 210-100 000 0090-R | for manipulation of patch clamp electrode |
| LED Light Source Control Module | Mightex | BLS-PL02_US | optogenetic light source control |
| Lidocaine | |||
| Lynx-8 Amplifier | Neuralynx | Retired | |
| Lynx-8 Power Supply | Neuralynx | Retired | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Dot Scientific | DSM24300 | ACSF |
| mCherry, Texas Red filter cube | Chroma | 49008 | for imaging tdTomato fluorescent reporter |
| Meloxicam | |||
| Micropipette holder | Fisher Scientific | NC9044962 | |
| Microsyringe pump | World Precision Instruments | UMP3-4 | |
| Mineral oil | Generic brand | ||
| MultiClamp 700A | Molecular Devices/Axon Instruments | 700A | Amplifier |
| Nitrogen (for air table) | Airgas | NI200 | |
| Nylon mesh | Fisher Scientific | 501460083 | stretched over horseshoe of flattened platinum wire, slice rest on top of this during recordings |
| Nylon, cut from pantyhose | Generic brand | small piece to create slice platform in incubation chamber, single fibers to create platinum harp | |
| Ophthalmic ointment | Fisher Scientific | NC1697520 | |
| Pipette | Dot Scientific | 307 | For transferring tissue to rig |
| Platinum wire | VWR International | BT124000 | 2 cm, flattened, to make platinum harp |
| Polygon400 | Mightex | DSI-E-0470-0617-000 | optogenetic light delivery system, comes with PolyScan2 software |
| Potassium Chloride (KCl) | Dot Scientific | DSP41000 | ACSF |
| Potassium Phosphate (KH2PO4) | Dot Scientific | DSP41200 | ACSF |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sapphire blade (for vibratome) | VWR International | 100492-502 | |
| Scalpel blade | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-361445 | |
| Sealed gas bag | Fisher Scientific | 109236 | |
| Shifting table for microscope | Luigs and Neumann | 380FMU | |
| Sodium Bicarbonate (HCO3-) | Dot Scientific | DSS22060 | ACSF |
| Sodium Chloride (NaCl) | Dot Scientific | DSS23020 | ACSF, intracellular solution |
| Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre) | The Jackson Laboratory | 013044 | SOM-Cre mouse |
| Stereotaxic instrument | Kopf | Model 902 | Dual Small Animal |
| Super glue | Staples | 886833 | to fix tissue block to specimen stage during slice preparation |
| Surgical drill | RAM Products Inc. | DIGITALMICROTORQUE | Microtorque II |
| Syringe (1 mL) with LuerLock tip | Fisher Scientific | 309628 | for application of pressure during patch clamping |
| Syringe (1 mL) with slip tip | WW Grainger, Inc. | 19G384 | for filling patch clamp pipettes |
| Syringe Filters | VWR International | 66064-414 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | |
| Vibrating microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| Wypall towels | Fisher Scientific | 19-042-427 |
References
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