Оптогенетическая активация афферентных путей в срезах мозга и модуляция реакций летучими анестетиками
Summary
Срезы мозга ex vivo могут быть использованы для изучения влияния летучих анестетиков на вызванные реакции на афферентные входы. Оптогенетика используется для независимой активации таламокортикальных и кортикокортикальных афферентов к непервичной неокортексе, а синаптические и сетевые реакции модулируются изофлураном.
Abstract
Анестетики влияют на сознание частично через свои действия на таламокортикальные цепи. Однако степень, в которой летучие анестетики влияют на различные клеточные и сетевые компоненты этих цепей, остается неясной. Срезы мозга ex vivo обеспечивают средство, с помощью которого исследователи могут исследовать дискретные компоненты сложных сетей и распутывать потенциальные механизмы, лежащие в основе воздействия летучих анестетиков на вызванные реакции. Чтобы изолировать потенциальные эффекты лекарств, специфичных для типа клеток и путей, в срезах мозга исследователи должны быть в состоянии независимо активировать пути афферентных волокон, идентифицировать неперекрывающиеся популяции клеток и применять летучие анестетики к ткани в водном растворе. В этом протоколе описаны методы измерения оптогенетически вызванных реакций на два независимых афферентных пути к неокортексу в срезах мозга ex vivo. Внеклеточные реакции регистрируются для анализа сетевой активности, а целевые записи зажимов цельноклеточного пластыря проводятся в соматостатин- и парвальбумин-положительных интернейронах. Описана доставка физиологически значимых концентраций изофлурана через искусственную спинномозговую жидкость для модуляции клеточных и сетевых реакций.
Introduction
Летучие анестетики повсеместно используются в различных клинических и академических условиях уже более века. Различные классы анестетиков имеют уникальные, часто не перекрывающиеся молекулярные мишени 1,2,3, но почти все они вызывают бессознательное состояние. Хотя их поведенческие эффекты вполне предсказуемы, механизмы, с помощью которых анестетики вызывают потерю сознания, в значительной степени неизвестны. Анестетики могут в конечном итоге влиять как на уровень, так и на содержание сознания посредством действий на кортикоталамические цепи, нарушая интеграцию информации по всей корковой иерархии 4,5,6,7,8,9. В более широком смысле, модуляция кортикоталамических цепей может играть роль в экспериментально10 или фармакологически11 измененных состояниях сознания, а также может быть вовлечена в сон12 и в патофизиологические расстройства сознания13,14.
Неуловимость механизмов, лежащих в основе потери и возвращения сознания во время анестезии, может быть частично объяснена нелинейными, синергетическими действиями анестетиков на клеточном, сетевом и системном уровнях15. Изофлуран, например, подавляет активность в выбранных областях мозга 16,17,18, ухудшает связь между удаленными областями мозга 19,20,21,22,23 и уменьшает синаптические реакции специфическим для пути способом 24,25 . Какие эффекты анестетиков, от молекулярного до системного уровня, необходимы или достаточны для потери сознания, остается неясным. В дополнение к существенным клиническим исследованиям сознания с использованием неинвазивных методов 19,20,26, важно, чтобы экспериментаторы стремились распутать различные клеточные и сетевые взаимодействия, которые обслуживают сознательный опыт.
Упрощая сложные взаимодействия, обнаруженные в неповрежденном мозге, срезы мозга ex vivo позволяют изучать изолированные компоненты динамических систем мозга9. Препарат с уменьшенным срезом сочетает в себе преимущества относительно неповрежденных анатомических структур локальных нейронных цепей с универсальностью манипуляций in vitro. Однако до недавнего времени методологические ограничения препятствовали изучению синаптических и цепных свойств дальнобойных входов в срезах мозга 27,28; извилистый путь кортикоталамических волоконных трактов сделал активацию независимых афферентных путей практически невозможной с помощью электрической стимуляции.
Изучение влияния анестетиков на препараты среза мозга создает дополнительные проблемы. При отсутствии интактной дыхательной и кровеносной системы обезболивающие средства должны применяться в ванне, а концентрации тщательно сопоставляться с расчетными концентрациями в месте воздействия. Для многих внутривенных анестетиков медленная скорость уравновешивания в тканях делает традиционные фармакологические исследования трудоемкими29,30. Исследование влияния летучих газовых анестетиков в препаратах ex vivo является более сговорчивым, но также представляет собой проблемы. К ним относятся преобразование ингаляционных доз парциального давления в водные концентрации и необходимость модифицированной системы доставки лекарственного средства в ткани через искусственную спинномозговую жидкость31.
Здесь описаны методы, с помощью которых исследователи могут извлечь выгоду из хорошо документированных физико-химических свойств летучего анестетика изофлурана для доставки лекарств в срезы мозга ex vivo, активировать специфические для пути и слоя входы в область коры, представляющую интерес, с высоким пространственно-временным разрешением и проводить одновременные ламинарные записи и целевые записи зажимов пластырей из отдельных популяций нейронов. В совокупности эти процедуры позволяют исследователям измерять летучие анестетик-индуцированные изменения в нескольких наблюдаемых электрофизиологических свойствах ответа, от синаптического до локального сетевого уровня.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой рукописи описан протокол оценки внутри- и внеклеточных реакций на избирательно активированные афферентные пути в срезах мозга ex vivo.
Использование оптогенетических инструментов и параллельных схем записи позволяет исследователям исследовать реакцию местного на…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Брайана Краузе за техническую поддержку и руководство по этому проекту.
Эта работа была поддержана Международным обществом исследований анестезии (IMRA to AR), Национальными институтами здравоохранения (R01 GM109086 to MIB) и Кафедрой анестезиологии, Школой медицины и общественного здравоохранения, Университет Висконсина, Мэдисон, Штат Висконсин, США.
Materials
| 2.5x broadfield objective lens | Olympus | MPLFLN2.5X | |
| 40x water immersion objective lens | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 95% O2/5% CO2 mixture | Airgas | Z02OX95R2003045 | |
| A16 probe | NeuroNexus | A16x1-2mm-100-177-A16 | 16-channel probe |
| AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP | Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core | ||
| Anesthetic gas monitor (POET II) | Criticare | 602-3A | |
| ATP, Magnesium Salt | Sigma Aldrich | A9187 | intracellular solution |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Laboratory | 007914 | Cre-dependent tdTomato mouse |
| B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J | The Jackson Laboratory | 008069 | PV-Cre mouse |
| Belly Dancer Shaker | Thomas Scientific | 1210H86-TS | for equilibration of sealed gas bags |
| Betadine solution | Generic brand | ||
| Bleach | Generic brand | for silver chloriding patch clamp electrode | |
| Bupivicaine | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Dot Scientific | DSC20010 | ACSF |
| Capillary glass (patch clamp recordings) | King Precision Glass, Inc. | KG-33 | Borosilicate, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, Length: 90.0mm |
| Capillary glass (viral injections) | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | 3.5" |
| Control of junior micromanipulator | Luigs and Neumann | SM8 | for control of junior micromanipulator |
| Control of manipulators and shifting table | Luigs and Neumann | SM7 | for control of multichannel electrode and shifting table |
| Digidata 1440A + Clampex 10 | Molecular Devices | 1440A | Digitizer and software |
| E-3603 tubing | Fisher Scientific | 14171208 | for delivery of 95% O2/5% CO2 gas mixture to incubation chamber + application of pressure during patch clamping |
| EGTA | Dot Scientific | DSE57060 | intracellular solution |
| ERP-27 EEG Reference/Patch Panel | Neuralynx | Retired | |
| Filling needle | World Precision Instruments | 50821912 | for filling patch clamp pipettes |
| Filter cube for imaging EYFP | Olympus | U-MRFPHQ | |
| Filter paper | Fisher Scientific | 09801E | lay over slice template during preparation of tissue block |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | 2.5×2.5 Box filament |
| Gas dispersion tube | Sigma Aldrich | CLS3953312C | |
| Glass syringe (100 mL) | Sigma Aldrich | Z314390 | for filling gas-sealed bags |
| Gluconic Acid, Potassium Salt (K-gluconate) | Dot Scientific | DSG37020 | intracellular solution |
| Glucose | Dot Scientific | DSG32040 | ACSF |
| GTP, Sodium Salt | Sigma Aldrich | G8877 | intracellular solution |
| Headstage-probe adaptor | NeuroNexus | A16-OM16 | adaptor to connect 16-channel probe to headstage input |
| Hemostatic Forceps | VWR International | 76192-096 | |
| HEPES | Dot Scientific | DSH75030 | ACSF,intracellular solution |
| HS-16 Headstage | Neuralynx | Retired | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Isopropyl alcohol (70%) | VWR International | 101223-746 | |
| Junior micromanipulator | Luigs and Neumann | 210-100 000 0090-R | for manipulation of patch clamp electrode |
| LED Light Source Control Module | Mightex | BLS-PL02_US | optogenetic light source control |
| Lidocaine | |||
| Lynx-8 Amplifier | Neuralynx | Retired | |
| Lynx-8 Power Supply | Neuralynx | Retired | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Dot Scientific | DSM24300 | ACSF |
| mCherry, Texas Red filter cube | Chroma | 49008 | for imaging tdTomato fluorescent reporter |
| Meloxicam | |||
| Micropipette holder | Fisher Scientific | NC9044962 | |
| Microsyringe pump | World Precision Instruments | UMP3-4 | |
| Mineral oil | Generic brand | ||
| MultiClamp 700A | Molecular Devices/Axon Instruments | 700A | Amplifier |
| Nitrogen (for air table) | Airgas | NI200 | |
| Nylon mesh | Fisher Scientific | 501460083 | stretched over horseshoe of flattened platinum wire, slice rest on top of this during recordings |
| Nylon, cut from pantyhose | Generic brand | small piece to create slice platform in incubation chamber, single fibers to create platinum harp | |
| Ophthalmic ointment | Fisher Scientific | NC1697520 | |
| Pipette | Dot Scientific | 307 | For transferring tissue to rig |
| Platinum wire | VWR International | BT124000 | 2 cm, flattened, to make platinum harp |
| Polygon400 | Mightex | DSI-E-0470-0617-000 | optogenetic light delivery system, comes with PolyScan2 software |
| Potassium Chloride (KCl) | Dot Scientific | DSP41000 | ACSF |
| Potassium Phosphate (KH2PO4) | Dot Scientific | DSP41200 | ACSF |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sapphire blade (for vibratome) | VWR International | 100492-502 | |
| Scalpel blade | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-361445 | |
| Sealed gas bag | Fisher Scientific | 109236 | |
| Shifting table for microscope | Luigs and Neumann | 380FMU | |
| Sodium Bicarbonate (HCO3-) | Dot Scientific | DSS22060 | ACSF |
| Sodium Chloride (NaCl) | Dot Scientific | DSS23020 | ACSF, intracellular solution |
| Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre) | The Jackson Laboratory | 013044 | SOM-Cre mouse |
| Stereotaxic instrument | Kopf | Model 902 | Dual Small Animal |
| Super glue | Staples | 886833 | to fix tissue block to specimen stage during slice preparation |
| Surgical drill | RAM Products Inc. | DIGITALMICROTORQUE | Microtorque II |
| Syringe (1 mL) with LuerLock tip | Fisher Scientific | 309628 | for application of pressure during patch clamping |
| Syringe (1 mL) with slip tip | WW Grainger, Inc. | 19G384 | for filling patch clamp pipettes |
| Syringe Filters | VWR International | 66064-414 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | |
| Vibrating microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| Wypall towels | Fisher Scientific | 19-042-427 |
References
- Baumgart, J. P., et al. Isoflurane inhibits synaptic vesicle exocytosis through reduced Ca2+ influx, not Ca2+-exocytosis coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 112 (38), 11959-11964 (2015).
- Herring, B. E., Xie, Z., Marks, J., Fox, A. P. Isoflurane inhibits the neurotransmitter release machinery. Journal of Neurophysiology. 102 (2), 1265-1273 (2009).
- Xie, Z., et al. Interaction of anesthetics with neurotransmitter release machinery proteins. Journal of Neurophysiology. 109 (3), 758-767 (2013).
- Crick, F., Koch, C. A framework for consciousness. Nature Neurosciences. 6 (2), 119-126 (2003).
- Koch, C., Massimini, M., Boly, M., Tononi, G. Neural correlates of consciousness: progress and problems. Nature Reviews Neurosciences. 17 (5), 307-321 (2016).
- Dehaene, S., Changeux, J. P. Experimental and theoretical approaches to conscious processing. Neuron. 70 (2), 200-227 (2011).
- Friston, K. A theory of cortical responses. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 360 (1456), 815-836 (2005).
- Mashour, G. A., Hudetz, A. G. Bottom-Up and Top-Down Mechanisms of General Anesthetics Modulate Different Dimensions of Consciousness. Frontiers in Neural Circuits. 11, 44 (2017).
- Voss, L. J., Garcia, P. S., Hentschke, H., Banks, M. I. Understanding the Effects of General Anesthetics on Cortical Network Activity Using Ex Vivo Preparations. Anesthesiology. 130 (6), 1049-1063 (2019).
- Redinbaugh, M. J., et al. Thalamus Modulates Consciousness Via Layer-Specific Control of Cortex. Neuron. 105 (4), 0896 (2020).
- Carhart-Harris, R. L., Friston, K. J. REBUS and the Anarchic Brain: Toward a Unified Model of the Brain Action of Psychedelics. Pharmacological Reviews. 71 (3), 316-344 (2019).
- Mak-McCully, R. A., et al. Coordination of cortical and thalamic activity during non-REM sleep in humans. Nature communications. 8 (1), 15499 (2017).
- Alkire, M. T., Hudetz, A. G., Tononi, G. Consciousness and anesthesia. Science. 322 (5903), 876-880 (2008).
- Sanders, R. D., Maze, M. Noradrenergic trespass in anesthetic and sedative states. Anesthesiology. 117 (5), 945-947 (2012).
- Hemmings, H. C., et al. Towards a Comprehensive Understanding of Anesthetic Mechanisms of Action: A Decade of Discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 40 (7), 464-481 (2019).
- Nourski, K. V., et al. Auditory Predictive Coding across Awareness States under Anesthesia: An Intracranial Electrophysiology Study. Journal of Neurosciences. 38 (39), 8441-8452 (2018).
- Liu, X., et al. Propofol disrupts functional interactions between sensory and high-order processing of auditory verbal memory. Human Brain Mapping. 33 (10), 2487-2498 (2012).
- Hentschke, H., Raz, A., Krause, B. M., Murphy, C. A., Banks, M. I. Disruption of cortical network activity by the general anesthetic isoflurane. British Journal of Anaesthesiology. 119 (4), 685-696 (2017).
- Lee, U., et al. Disruption of frontal-parietal communication by ketamine, propofol, and sevoflurane. Anesthesiology. 118 (6), 1264-1275 (2013).
- Ferrarelli, F., et al. Breakdown in cortical effective connectivity during midazolam-induced loss of consciousness. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 107 (6), 2681-2686 (2010).
- Ku, S. W., Lee, U., Noh, G. J., Jun, I. G., Mashour, G. A. Preferential inhibition of frontal-to-parietal feedback connectivity is a neurophysiologic correlate of general anesthesia in surgical patients. PLoS.One. 6 (10), 25155 (2011).
- Lee, M., et al. Network Properties in Transitions of Consciousness during Propofol-induced Sedation. Scientific Reports. 7 (1), 16791 (2017).
- Murphy, M., et al. Propofol anesthesia and sleep: a high-density EEG study. Sleep. 34 (3), 283-291 (2011).
- Murphy, C., Krause, B., Banks, M. Selective effects of isoflurane on cortico-cortical feedback afferent responses in murine non-primary neocortex. British Journal of Anaesthesiology. 123 (4), 488-496 (2019).
- Raz, A., et al. Preferential effect of isoflurane on top-down versus bottom-up pathways in sensory cortex. Frontiers in System Neurosciences. 8, 191 (2014).
- Schrouff, J., et al. Brain functional integration decreases during propofol-induced loss of consciousness. Neuroimage. 57 (1), 198-205 (2011).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-Specific Feedforward Circuits between Thalamus and Neocortex Revealed by Selective Optical Stimulation of Axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gredell, J. A., Turnquist, P. A., MacIver, M. B., Pearce, R. A. Determination of diffusion and partition coefficients of propofol in rat brain tissue: implications for studies of drug action in vitro. BJA: British Journal of Anaesthesia. 93 (6), 810-817 (2004).
- Benkwitz, C., et al. Determination of the EC50 amnesic concentration of etomidate and its diffusion profile in brain tissue: implications for in vitro studies. Anesthesiology. 106 (1), 114-123 (2007).
- Franks, N. P., Lieb, W. R. Selective actions of volatile general anaesthetics at molecular and cellular levels. British Journal of Anaesthesia. 71 (1), 65-76 (1993).
- Honemann, C. W., Washington, J., Honemann, M. C., Nietgen, G. W., Durieux, M. E. Partition coefficients of volatile anesthetics in aqueous electrolyte solutions at various temperatures. Anesthesiology. 89 (4), 1032-1035 (1998).
- Au – Segev, A., Au – Garcia-Oscos, F., Au – Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Lin, J. Y. A user’s guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Experimental Physiology. 96 (1), 19-25 (2011).
- Banks, M. I., Pearce, R. A. Dual actions of volatile anesthetics on GABAA IPSCs: dissociation of blocking and prolonging effects. Anesthesiology. 90 (1), 120-134 (1999).
- Hagan, C. E., Pearce, R. A., Trudell, J. R., MacIver, M. B. Concentration measures of volatile anesthetics in the aqueous phase using calcium sensitive electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 81, 177-184 (1998).
