Drosophila Larvaları Kullanılarak Termogenetik Nöronal Ekranda Makro besin alımının nicelleştirilmesi
Summary
Burada açıklanan, farklı makro besin kalitesinde diyetlere maruz kalan Drosophila melanogaster larvaları tarafından belirli bir zaman aralığında yenen yiyecek miktarının kolorimetrik olarak ölçülmesini sağlayan bir protokoldür. Bu tahliller nöronal termogenetik ekran bağlamında gerçekleştirilir.
Abstract
Yemleme ve beslenme davranışları, hayvanların gelişimleri, sağlıkları ve zindelikleri için gerekli olan enerji ve besin kaynaklarına erişmelerini sağlar. Bu davranışların nöronal regülasyonunun araştırılması, beslenme homeostazının altında kalan fizyolojik ve moleküler mekanizmaların anlaşılması için gereklidir. Solucanlar, sinekler ve balıklar gibi genetik olarak çekilebilir hayvan modellerinin kullanılması bu tür çalışmaları büyük ölçüde kolaylaştırır. Son on yılda, meyve sineği Drosophila melanogaster, beslenme ve yemleme davranışlarının nöronal kontrolünü araştıran nörobiyologlar tarafından güçlü bir hayvan modeli olarak kullanılmıştır. Şüphesiz değerli olsa da, çoğu çalışma yetişkin sinekleri inceler. Burada, larvalar protein ve karbonhidrat içeriğinde farklı diyetlere maruz kaldıklarında beslenme davranışlarını kontrol eden nöronal substratları araştırmak için daha basit larva sinir sisteminden yararlanan bir protokol açıklıyoruz. Yöntemlerimiz, nöronal termogenetik aktivasyon ekranı bağlamında gerçekleştirilen nicel kolorimetrik seçimsiz besleme testine dayanmaktadır. Bir okuma olarak, larvalar tarafından 1 saat aralıklarla yenen yiyecek miktarı, proteinlerinde karbonhidrat (P:C) oranlarına göre farklılık gösteren üç boya etiketli diyetten birine maruz kaldığında kullanılmıştır. Bu protokolün etkinliği larva Drosophila’danörogenetik bir ekran bağlamında gösterilmiştir Farklı makro besin kalitesindeki diyetlerde yenen yiyecek miktarını düzenleyen aday nöronal popülasyonları belirleyerek. Ayrıca test edilen genotipleri fenotipik sınıflar halinde sınıflandırabildik ve gruplandırabildik. Literatürde mevcut yöntemlerin kısa bir incelemesinin yanı sıra, bu yöntemlerin avantajları ve sınırlamaları tartışılır ve ayrıca, bu protokolün diğer özel deneylere nasıl uyarlanabileceği hakkında bazı öneriler sağlanmaktadır.
Introduction
Tüm hayvanlar hayatta kalmak, büyümek ve üremek için gerekli miktarda besin elde etmek için dengeli bir diyete bağımlıdır1. Ne ve ne kadar yiyeceğinin seçimi, tokluk seviyesi gibi hayvanın iç durumu ve gıda kalitesi2 ,3,4,5gibi çevresel koşullarla ilgili çok sayıda etkileşim faktöründen etkilenir. Protein ve karbonhidratlar iki ana makro besin maddesidir ve hayvanların fizyolojik süreçlerini sürdürmek için dengeli alımı esastır. Bu nedenle, beslenme davranışlarını kontrol eden ve bu makro besinlerin dengeli bir şekilde alımını sürdüren sinir mekanizmalarının anlaşılması son derece önemlidir. Bunun nedeni, yaşam süresi, doğurganlık ve metabolik sağlık gibi yaşam öyküsü özelliklerinin protein alımı 6,7 ,8,9,10seviyelerinden doğrudan etkilenmesidir.
Memeliler de dahil olmak üzere karmaşık hayvanlarla evrimsel olarak korunmuş beslenme alışkanlıkları sergileyen daha basit daha çekişli organizmaların kullanımı bu tür çalışmalar için gereklidir. Daha da önemlisi, bu daha basit hayvan modelleri, karmaşık biyolojik soruları maliyetli, etik ve teknik olarak daha etkili bir bağlamda incelerken iyi bir fırsat sağlar. Son yıllarda, Drosophila, güçlü genetik araç seti, karmaşık ve basmakalıp davranışı ve memeliler ile periferik ve besin algılama mekanizmalarının korunmuş mimarisi ile davranışsal nörobiyologlar için verimli bir model olmuştur11. Sonuçta, umut, bu hayvanda yiyecek alımının nasıl düzenlendiğini anlayarak, daha basit bir sinir sistemiyle, daha sonra insan yeme bozukluklarının altında kalan nöronal arızaları çözebilmemizdir.
Beslenme davranışları için nöronal substratların incelenmesi, nöronal aktivitelerini manipüle ederken hayvanların yiyecek alımını aynı anda ölçebilmeye derinden bağlıdır. Yutulmuş minimum miktarda yiyecek nedeniyle, sinekler tarafından yenen yiyecek miktarını ölçmek son derece zordur ve şu anda mevcut olan tüm yöntemler önemli sınırlamalar sunun. Bu nedenle, altın standart tamamlayıcı metodolojilerin bir kombinasyonunu kullanmaktır12. Yetişkin sinekler tarihsel olarak genetik ve davranışsal bir model olarak tercih edilmiştir. Bununla birlikte, Drosophila larvaları, beslenme davranışını kodlayan nöronal substratları araştırmak için fırsatlar da sunar. Yaklaşık 12.000 nöron içeren larva merkezi sinir sistemi (CNS), yaklaşık 150.000 nöron içeren yetişkinden önemli ölçüde daha az karmaşıktır. Bu düşük karmaşıklık sadece sayısal değil, aynı zamanda işlevseldir, çünkü larva davranışları daha basit lokomotif işlevlerine ve duyusal sistemlere dayanır. Sinir sistemlerinin belirgin basitliğine rağmen, larvalar hala tam beslenme davranışları sergiler ve Drosophila larvalarında gıda yutulmasını ölçmek için bazı yöntemlertanımlanmıştır 5,13,14,15. Nöronal aktivite manipülasyonları ile eşleştirerek, Drosophila larvaları gıda alımının sinirsel düzenlemesini anlamak için oldukça çekişli bir model oluşturabilir.
Burada, farklı makro besin kalitesinde diyetlere maruz kalan larvalarda gıda alımını ölçmek için ayrıntılı bir protokol verilmiştir. Makro besin dengeleme diyetleri olarak adlandırılan diyetler, protein ve karbonhidrat içeriğinde, özellikle proteinden karbonhidrata (P:C) oranlarına göre farklılık göstermiştir: Şekil 1A’da gösterildiği gibi 1:1 (protein bakımından zengin diyet), 1:4 (ara diyet) ve 1:16(proteinden fakir diyet). Kısaca, mavi bir gıda boyası ile boyanmış bu üç izokalorik sakkaroz mayası (SY) bazlı diyet kullanılarak nicel bir seçimsiz beslenme tahlili kuruldu. Maya özü ve sakkaroz protein ve karbonhidrat kaynakları olarak kullanıldığından ve her ikisi de karbonhidrat içerdiğinden, daha önce16 olarak açıklandığı gibi ve Şekil 1B’debelirtildiği gibi, bu iki bileşenin dengesi değiştirilerek P:C oranlarında değişim elde edilmiştir. Ana deneysel adımları gösteren protokole şematik bir genel bakış Şekil 2‘de mevcuttur.
Bu protokol, farklı P:C oranlarındaki diyetlerde ve termogenetik nöronal ekran bağlamında larva besleme seviyelerinin düzenlenmesinde spesifik nöronal popülasyonların rolünü araştırmak amacıyla kurulmuştur. Geçici Reseptör Potansiyeli (TRP) ailesinden iyi karakterize edilmiş bir nörogenetik araç kullanıldı: Drosophila Geçici Reseptör Potansiyel kanalı (dTRPA1), bir sıcaklık ve voltaj kapılı katyon kanalıdır, ortam sıcaklıkları 25 °C17’ninüzerine çıktığında eylem potansiyellerinin ateşlenmesine izin verir. dTRPA1 transgene’i ifade etmek için, Janelia Araştırma Kampüsü18,19’dakiFlyLight projesi kapsamında Rubin laboratuvarında kurulan Drosophila genomundan cis-düzenleyici bölgelere dayanan Gal4 hatlarından yararlandık.
Burada açıklanan protokol bir aktivasyon ekranı bağlamında kurulmuş olsa da, deneyci tarafından diğer özel ihtiyaçlara veya ilgi alanlarına kolayca uyarlanabilir, yani sıcaklığa duyarlı nöronal susturucu ShibireTS20kullanarak bir bastırma ekranı gerçekleştirmek için dTRPA1’e alternatif olarak. Bu ve diğer uyarlamalar protokol ve tartışma bölümlerinde ele alınmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolle, farklı P:C bileşimindeki diyetlere maruz kaldığında, iki ana makro besin olan protein ve karbonhidratların alım seviyelerini düzenlemek için belirli nöronal popülasyonların termogenetik aktivasyonu altındaki larvaların yeteneğini test edebilirsiniz. Bu yöntem, farklı makro besin kalitesindeki diyetler arasında gıda alımının kontrolü ile ilişkili nöronal popülasyonları tanımlamayı amaçlayan bir larva ön taraması bağlamında test edildi. Bu çalışma ayrıca Drosophila</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Instituto Gulbenkian de Ciência’ya (IGC) bu protokolde açıklanan deneysel ekipmanın bir kısmına erişim sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma Portekiz Bilim ve Teknoloji Vakfı (FCT), LISBOA-01-0145-FEDER-007660, PTDC/NEU- NMC/2459/2014, IF/00697/2014 ve La Caixa HR17-00595 pmd ve avustralya araştırma konseyi gelecek bursu (FT170100259) tarafından CKM için.
Materials
| 1.5 mL microtubes | Sarstedt AG & Co. | 72.690.001 | |
| 10xPBS | Nytech | MB18201 | |
| 2.0 mL microtubes | Sarstedt AG & Co. | 72.695.500 | |
| 60 mm petri dishes | Greiner Bio-one, Austria | 628161 | |
| 96 well microplates | Santa Cruz Biotechnology | SC-204453 | |
| Agar | Pró-vida, Portugal | ||
| Bench cooler | Nalgene, USA | Labtop Cooler 5115-0032 | |
| Blue food dye | Rayner, Billingshurst, UK | ||
| Cell disruption media | Scientific Industries, Inc. | 888-850-6208 | (0.5 mm glass beads) |
| Dish weight boats | Santa Cruz Biotechnology | SC-201606 | |
| Embryo collection cage for 60 mm petri dishes | Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK | FLY1212 (59-100) | |
| Featherweight forceps | BioQuip Products, USA | 4750 | |
| Fly food for stocks maintenance | 1 L food contains: 10 g Agar, 100 g Yeast Extract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionic acid | ||
| Forceps #5 | Dumont | 0108-5-PS | Standard tips, INOX, 11cm |
| Incubator | LMS Ltd, UK | Series 2, Model 230 | For thermogenetic feeding assay (30∘C) |
| Incubator | Percival Scientific, USA | DR36NL | To stage larvae (19∘C) |
| Janelia lines | Janelia Research Campus | Detailed information in Table 2 | |
| Macronutrient balancing diets | Composition and nutritional information in Figure 1 | ||
| Methanol | VWR | CAS number: 67-56-1 | |
| Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Nitrile gloves | VWR, USA | ||
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | 5804 R / Serial number: 5805CI364293 | |
| Rubin Gal4 ines | Janelia Research Campus | Stoks available at Bloomington Drosophila Stock Center | |
| ShibireTS UAS line | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC number: 66600 | Provided by Carlos Ribeiro Group |
| Soft brushes | For sorting anaesthetised fruit flies | ||
| Spectrophotometer plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan Go 51119300 | |
| Stereo microscope | Nikon | 1016625 | |
| Sucrose | Sidul, Portugal | ||
| Third-instar larvae (L3) rearing diet | Composition and nutritional information in Figure 1 | ||
| Timer | |||
| Tissue lyzer / bead beater | MP Biomedicals, USA | FastPrep-24 6004500 | |
| TRPA1 UAS line | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC number: 26264 | Expresses TrpA1 under UAS control; may be used to activate neurons experimentally at 25 ∘C |
| Water bath | Sheldon Manufacturing Inc., USA | W20M-2 / 03068308 / 9021195 | |
| Yeast extract | Pró-vida, Portugal | 51% Protein, 15% Carbohydrate |
References
- Raubenheimer, D. . Nature of nutrition – a unifying framework from animal adaptation to human. , (2012).
- Carvahlo, M. J. a., Mirth, C. K. Coordinating morphology with behavior during development: an integrative approach from a fly perspective. Frontiers in Ecology and Evolution. , (2015).
- Steck, K., et al. Internal amino acid state modulates yeast taste neurons to support protein homeostasis in Drosophila. Elife. 7, 31625 (2018).
- Itskov, P. M., Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Frontiers in Neuroscience. 7, 12 (2013).
- Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
- Grandison, R. C., Piper, M. D., Partridge, L. Amino-acid imbalance explains extension of lifespan by dietary restriction in Drosophila. Nature. 462 (7276), 1061-1064 (2009).
- Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2498-2503 (2008).
- Levine, M. E., et al. Low protein intake is associated with a major reduction in IGF-1, cancer, and overall mortality in the 65 and younger but not older population. Cell Metabolism. 19 (3), 407-417 (2014).
- Solon-Biet, S. M., et al. The ratio of macronutrients, not caloric intake, dictates cardiometabolic health, aging, and longevity in ad libitum-fed mice. Cell Metabolism. 19 (3), 418-430 (2014).
- Piper, M. D., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nature Methods. 11 (1), 100-105 (2014).
- Jones, W. D. The expanding reach of the GAL4/UAS system into the behavioral neurobiology of Drosophila. BMB Reports. 42 (11), 705-712 (2009).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Neckameyer, W. S. A trophic role for serotonin in the development of a simple feeding circuit. Developmental Neuroscience. 32 (3), 217-237 (2010).
- Gasque, G., Conway, S., Huang, J., Rao, Y., Vosshall, L. B. Small molecule drug screening in Drosophila identifies the 5HT2A receptor as a feeding modulation target. Scientific Reports. 3, (2013).
- Schoofs, A., et al. Selection of motor programs for suppressing food intake and inducing locomotion in the Drosophila brain. PLoS Biology. 12 (6), 1001893 (2014).
- Pocas, G. M., Crosbie, A. E., Mirth, C. K. When does diet matter? The roles of larval and adult nutrition in regulating adult size traits in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. , 104051 (2020).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Reports. 2 (4), 991-1001 (2012).
- Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. Journal of Neurobiology. 47 (2), 81-92 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Shirangi, T. R., Stern, D. L., Truman, J. W. Motor control of Drosophila courtship song. Cell Reports. 5 (3), 678-686 (2013).
- Mirth, C. M. J. Food intake and food choice are altered by the developmental transition at critical weight in Drosophila melanogaster. Animal Behaviour. 126, 195-208 (2017).
- Simpson, S. J., Raubenheimer, D. Obesity: the protein leverage hypothesis. Obesity Reviews. 6 (2), 133-142 (2005).
- Raubenheimer, D., Simpson, S. J. Integrative models of nutrient balancing: application to insects and vertebrates. Nutrition Research Reviews. 10 (1), 151-179 (1997).
- Li, H. H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Reports. 8 (3), 897-908 (2014).
- Bhatt, P. K., Neckameyer, W. S. Functional analysis of the larval feeding circuit in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (81), e51062 (2013).
- Wong, R., Piper, M. D. W., Blanc, E., Partridge, L. Pitfalls of measuring feeding rate in the fruit fly Drosophila melanogaster. Nature Methods. 5 (3), 214-215 (2008).
- Almeida-Carvalho, M. J., et al. The Ol1mpiad: concordance of behavioural faculties of stage 1 and stage 3 Drosophila larvae. Journal of Experimental Biology. 220, 2452-2475 (2017).
- Rodrigues, M. A., et al. Drosophila melanogaster larvae make nutritional choices that minimize developmental time. Journal of Insect Physiology. 81, 69-80 (2015).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), 6063 (2009).
- Wu, Q., et al. Developmental control of foraging and social behavior by the Drosophila neuropeptide Y-like system. Neuron. 39 (1), 147-161 (2003).
- Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13289-13294 (2005).
- Lingo, P. R., Zhao, Z., Shen, P. Co-regulation of cold-resistant food acquisition by insulin- and neuropeptide Y-like systems in Drosophila melanogaster. Neuroscience. 148 (2), 371-374 (2007).
