ショウジョウバエ幼虫を用いた熱遺伝学的神経細胞スクリーンにおけるマクロ栄養素摂取量の定量化
Summary
ここで説明するプロトコルは、異なる大栄養素の質の食事にさらされた ショウジョウバエメラノガスター 幼虫によって定義された間隔内に食べられる食物の量の着色定量を可能にするプロトコルである。これらのアッセイは、神経細胞の熱遺伝学的スクリーンの文脈で行われる。
Abstract
飼育と摂食行動は、動物が発達、健康、フィットネスに不可欠なエネルギーと栄養素の源にアクセスすることを可能にします。これらの行動の神経調節を調査することは、栄養恒常性の基礎となる生理学的および分子的メカニズムの理解に不可欠である。このようなワーム、ハエ、魚などの遺伝的に難しい動物モデルの使用は、研究のこれらのタイプを大幅に容易にします。過去10年間、フルーツフライショウジョウバエメラノガスターは、摂食行動と採餌行動の神経制御を調査する神経生物学者によって強力な動物モデルとして使用されてきました。間違いなく貴重ですが、ほとんどの研究は大人のハエを調べます。ここでは、幼虫がタンパク質と炭水化物の含有量が異なる食事にさらされたときに摂食行動を制御する神経基質を調査するために、より単純な幼虫神経系を利用するプロトコルについて説明する。我々の方法は、神経細胞の熱遺伝学的活性化スクリーンの文脈で行われる定量的な無選択供給アッセイに基づいている。読み出しとして、1時間間隔で幼虫が食べる食物の量は、タンパク質と炭水化物(P:C)比が異なる3つの染料標識食餌の1つにさらされるときに使用された。このプロトコルの有効性は、幼虫ショウジョウバエの神経遺伝学的スクリーンの文脈で、異なる大栄養素の質の食事で食べられる食物の量を調節する候補神経集団を同定することによって実証される。また、試験した遺伝子型を分類して分類して、その遺伝子型を分類して分類することができました。文献で現在利用可能な方法の簡単なレビューに加えて、これらの方法の利点と限界が議論され、また、このプロトコルが他の特定の実験にどのように適応されるかについてのいくつかの提案が提供される。
Introduction
すべての動物は、生存、成長、および生殖に必要な量の栄養素を獲得するためにバランスのとれた食事に依存しています1.食べるものの選択は、満腹レベルのような動物の内部状態に関連する多数の相互作用要因と、食品品質2、3、4、5などの環境条件の影響を受ける。タンパク質と炭水化物は2つの主要な栄養素であり、そのバランスのとれた摂取量は動物の生理学的プロセスを維持するために不可欠です。したがって、摂食行動を制御し、これらの大栄養素のバランスのとれた摂取量を維持する神経機構の理解は非常に重要である。これは、寿命、胎児性、代謝の健康などの生命史の形質は、タンパク質摂取摂取量6、7、8、9、10のレベルによって直接影響を受けるからです。
哺乳類を含む複雑な動物との進化的に保存された摂食習慣を示すより単純でより難易な生物の使用は、この種の研究に不可欠である。重要なことに、これらの単純な動物モデルは、高価で倫理的かつ技術的により効果的な文脈で複雑な生物学的質問を解剖する良い機会を提供します。過去数十年の間に、 ショウジョウバエは、その強力な遺伝的ツールキット、複雑でステレオタイプな行動、哺乳類との末梢および栄養センシング機構の保存されたアーキテクチャを有し、行動神経生物学者11のための実りあるモデルとなっている。最終的には、より単純な神経系を持つこの動物の食物摂取量がどのように調節されているかを理解することで、人間の摂食障害の根底にある神経機能不全を解き始めることができると期待しています。
摂食行動のための神経基質の研究は、動物の食物摂取量を同時に測定しながら、その神経活動を操作できることに深く依存している。摂取される食品の量が最小限であるため、ハエが食べる食品の量を定量することは非常に困難であり、現在利用可能なすべての方法は重要な制限を提示します。従って、ゴールドスタンダードは、相補的方法論12の組み合わせを使用する。成虫ハエは歴史的に遺伝的および行動モデルとして支持されてきた。それにもかかわらず、ショウジョウバエ幼虫は、摂食行動をコードする神経基質を調査する機会も提供する。約12,000個のニューロンを持つ幼虫中枢神経系(CNS)は、約150,000個のニューロンを含む成人のそれよりも有意に複雑ではありません。幼虫の挙動は、より単純な機関車機能と感覚システムに依存しているため、この低い複雑さは数値だけでなく機能的でもあります。彼らの神経系の明らかな単純さにもかかわらず、幼虫はまだ完全な摂食行動を示し、ショウジョウバエの幼虫における食物摂取を定量化するいくつかの方法は5、13、14、15に記載されている。神経活動の操作と組み合わせることで、ショウジョウバエの幼虫は食物摂取の神経調節を理解するための非常に難解なモデルを構成することができる。
ここでは、異なる栄養素の質の食事にさらされた幼虫の食物摂取量を定量化するための詳細なプロトコルが提供されています。食事、いわゆるマクロ栄養素バランス食は、タンパク質および炭水化物の内容が異なり、特にタンパク質対炭水化物(P:C)比:1:1(タンパク質豊富な食事)、1:4(中間食)、および1:16(タンパク質貧しい食事)を 図1Aに示した。簡単に言えば、青色食品染料を染めたこれら3つのイソカロリックスクロース酵母(SY)ベースの食事を用いて定量的な無選択給餌アッセイを確立した。酵母エキスとショ糖はタンパク質と炭水化物源として使用され、両方とも炭水化物を含むため、P:C比の変動は、上記の16 と 図1Bに示すように、これら2つの成分のバランスを変化させることによって得られた。主な実験手順を示すプロトコルの概略図を 図 2に示します。
このプロトコルは、異なるP:C比の食事における幼虫摂食レベルの調節および熱遺伝学的神経細胞の文脈における特定の神経集団の役割を調査することを目的として設立された。過渡受容体ポテンシャル(TRP)ファミリーからよく特徴付けられた神経遺伝学的ツールを使用しました:ショウジョウバエ過渡受容体電位チャネル (dTRPA1), 温度と電圧ゲートカチオンチャネルであります, 周囲温度が25 °C17を超えて上昇したときに作用電位の発射を可能にします.dTRPA1トランスジーンを表現するために、我々はジャネリア研究キャンパス18、19でFlyLightプロジェクトの文脈で、ルービン研究所に設立されたショウジョウバエゲノムからのシス-調節領域に基づくGal4ラインを利用しました。
プロトコルは、ここで説明する、活性化画面のコンテキストで確立されているが、実験者が他の特定のニーズまたは興味に容易に適応させることができる、すなわち温度感受性神経サイレンサーShibireTS20を用いて抑制画面を実行し、dTRPA1に代わるものである。この他の適応については、プロトコルとディスカッションのセクションで説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルを使用すると、異なるP:C組成の食事にさらされたときに、タンパク質と炭水化物の摂取量を調節する特定の神経集団の熱遺伝学的活性化の下で幼虫の能力をテストすることができます。この方法は、異なる栄養素の質の異なる食事全体の食物摂取量の制御に関連する神経集団を同定することを目的とした幼虫予備スクリーニングの文脈で試験された。この研究はまた、ショ <em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロトコルに記載されている実験装置の一部にアクセスを提供してくれたグルベンキアン・デ・シエンシア研究所(IGC)に感謝します。この研究は、ポルトガル科学技術財団(FCT)、LISBOA-01-0145-FEDER-007660によって支援されました。 PTDC/NEU- NMC/2459/2014,IF/00697/2014,ラカイシャHR17-00595をPMDに、オーストラリア研究評議会未来フェローシップ(FT170100259)からCKMへ。
Materials
| 1.5 mL microtubes | Sarstedt AG & Co. | 72.690.001 | |
| 10xPBS | Nytech | MB18201 | |
| 2.0 mL microtubes | Sarstedt AG & Co. | 72.695.500 | |
| 60 mm petri dishes | Greiner Bio-one, Austria | 628161 | |
| 96 well microplates | Santa Cruz Biotechnology | SC-204453 | |
| Agar | Pró-vida, Portugal | ||
| Bench cooler | Nalgene, USA | Labtop Cooler 5115-0032 | |
| Blue food dye | Rayner, Billingshurst, UK | ||
| Cell disruption media | Scientific Industries, Inc. | 888-850-6208 | (0.5 mm glass beads) |
| Dish weight boats | Santa Cruz Biotechnology | SC-201606 | |
| Embryo collection cage for 60 mm petri dishes | Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK | FLY1212 (59-100) | |
| Featherweight forceps | BioQuip Products, USA | 4750 | |
| Fly food for stocks maintenance | 1 L food contains: 10 g Agar, 100 g Yeast Extract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionic acid | ||
| Forceps #5 | Dumont | 0108-5-PS | Standard tips, INOX, 11cm |
| Incubator | LMS Ltd, UK | Series 2, Model 230 | For thermogenetic feeding assay (30∘C) |
| Incubator | Percival Scientific, USA | DR36NL | To stage larvae (19∘C) |
| Janelia lines | Janelia Research Campus | Detailed information in Table 2 | |
| Macronutrient balancing diets | Composition and nutritional information in Figure 1 | ||
| Methanol | VWR | CAS number: 67-56-1 | |
| Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Nitrile gloves | VWR, USA | ||
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | 5804 R / Serial number: 5805CI364293 | |
| Rubin Gal4 ines | Janelia Research Campus | Stoks available at Bloomington Drosophila Stock Center | |
| ShibireTS UAS line | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC number: 66600 | Provided by Carlos Ribeiro Group |
| Soft brushes | For sorting anaesthetised fruit flies | ||
| Spectrophotometer plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan Go 51119300 | |
| Stereo microscope | Nikon | 1016625 | |
| Sucrose | Sidul, Portugal | ||
| Third-instar larvae (L3) rearing diet | Composition and nutritional information in Figure 1 | ||
| Timer | |||
| Tissue lyzer / bead beater | MP Biomedicals, USA | FastPrep-24 6004500 | |
| TRPA1 UAS line | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC number: 26264 | Expresses TrpA1 under UAS control; may be used to activate neurons experimentally at 25 ∘C |
| Water bath | Sheldon Manufacturing Inc., USA | W20M-2 / 03068308 / 9021195 | |
| Yeast extract | Pró-vida, Portugal | 51% Protein, 15% Carbohydrate |
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