Quantificação da ingestão de Macronutrientes em uma Tela Neuronal Termogenética usando Larvas de Drosophila

Todos os animais dependem de uma dieta equilibrada para adquirir as quantidades necessárias de nutrientes para sobrevivência, crescimento e reprodução¹. A escolha do que e do quanto comer é influenciada por uma infinidade de fatores de interação relacionados ao estado interno do animal, como o nível de saciedade, e condições ambientais, como a qualidade dos alimentos^2,3,4,5. Proteínas e carboidratos são dois grandes macronutrientes e sua ingestão equilibrada é essencial para sustentar os processos fisiológicos dos animais. Portanto, a compreensão dos mecanismos neurais que controlam os comportamentos alimentares e sustentam uma ingestão equilibrada desses macronutrientes é extremamente relevante. Isso ocorre porque traços da história da vida como vida útil, fecundidade e saúde metabólica são diretamente afetados pelos^níveisde ingestão de proteínas 6^,7,8,9,10.

O uso de organismos mais simples e tratáveis que exibem hábitos alimentares evolutivamente conservados com animais complexos, incluindo mamíferos, é essencial para esse tipo de estudo. É importante ressaltar que esses modelos animais mais simples proporcionam uma boa oportunidade para dissecar questões biológicas complexas em um contexto caro, ético e tecnicamente mais eficaz. Nas últimas décadas, a Drosophila, com seu poderoso kit de ferramentas genéticas, comportamento intrincado e estereotipado e arquitetura conservada de mecanismos periféricos e sensoriais de nutrientes com mamíferos, tem sido um modelo frutífero para neurobiólogos comportamentais¹¹. Em última análise, a esperança é que, ao entender como a ingestão de alimentos é regulada neste animal, com um sistema nervoso mais simples, podemos então começar a desembaraçar os defeitos neuronais subjacentes aos distúrbios alimentares humanos.

O estudo de substratos neuronais para comportamentos alimentares depende profundamente de ser capaz de medir simultaneamente a ingestão alimentar dos animais enquanto manipula sua atividade neuronal. Devido às quantidades mínimas de alimentos ingeridos, quantificar a quantidade de alimentos comidos por moscas é extremamente desafiador, e todos os métodos atualmente disponíveis apresentam limitações significativas. Assim, o padrão-ouro é utilizar uma combinação de metodologias complementares¹². Moscas adultas têm sido historicamente favorecidas como um modelo genético e comportamental. No entanto, as larvas de Drosophila também oferecem oportunidades para investigar substratos neuronais codificando o comportamento alimentar. O sistema nervoso central larval (SNC), com cerca de 12.000 neurônios, é significativamente menos complexo que o do adulto, que contém aproximadamente 150.000 neurônios. Essa menor complexidade não é apenas numérica, mas também funcional, uma vez que os comportamentos larvais dependem de funções locomotivas mais simples e sistemas sensoriais. Apesar da aparente simplicidade de seus sistemas nervosos, as larvas ainda apresentam comportamentos alimentares completos, e alguns métodos para quantificar a ingestão de alimentos em larvas de Drosophila foram descritos^5,13,14,15. Ao emparelhar-se com manipulações da atividade neuronal, as larvas de Drosophila podem constituir um modelo altamente tratável para entender a regulação neural da ingestão alimentar.

Prevê-se aqui um protocolo detalhado para quantificar a ingestão de alimentos em larvas expostas a dietas de diferentes qualidades de macronutrientes. As dietas, as chamadas dietas de equilíbrio macronutrientes, diferem nos teores de proteínas e carboidratos, especificamente no que diz respeito às relações proteína-carboidrato (P:C): 1:1 (dieta rica em proteínas), 1:4 (dieta intermediária) e 1:16 (dieta pobre em proteínas), como mostra a Figura 1A. Resumidamente, um ensaio quantitativo de alimentação sem escolha foi estabelecido usando essas três dietas isocalóricas à base de sacarose (SY) tingidas com um corante alimentar azul. Como o extrato de levedura e a sacarose foram utilizados como fontes de proteína e carboidratos, e ambos contêm carboidratos, a variação nas relações P:C foi obtida pela alteração do equilíbrio desses dois componentes, conforme descrito anteriormente¹⁶ e como indicado na Figura 1B. Uma visão geral esquemática do protocolo, mostrando as principais etapas experimentais, está disponível na Figura 2.

Este protocolo foi estabelecido com o objetivo de investigar o papel de populações neuronais específicas na regulação dos níveis de alimentação larval em dietas de diferentes relações P:C e no contexto de uma tela neuronal termogenética. Uma ferramenta neurogenética bem caracterizada foi utilizada a partir da família Transitório Receptor Potential (TRP): Drosophila Transient Receptor Potential channel (dTRPA1), que é um canal de cáção fechado de temperatura e tensão, permitindo o disparo de potenciais de ação quando as temperaturas ambientes sobem acima de 25 °C¹⁷. Para expressar o transgene dTRPA1, aproveitamos as linhas Gal4 baseadas em regiões cis-regulatórias do genoma Drosophila, estabelecidas no laboratório Rubin, no contexto do projeto FlyLight no Janelia Research Campus^18,19.

Embora o protocolo, aqui descrito, tenha sido estabelecido no contexto de uma tela de ativação, ele pode ser facilmente adaptado pelo experimentador para outras necessidades ou interesses específicos, ou seja, realizar uma tela de supressão usando o silenciador neuronal sensível à temperatura ShibireTS^20,em alternativa ao dTRPA1. Esta e outras adaptações são discutidas nas seções de protocolo e discussão.