Количественная оценка приема макроэлементов в термогенетического нейронального экрана с использованием drosophila Larvae

Все животные зависят от сбалансированного питания, чтобы приобрести необходимое количество питательных веществ для выживания, роста и воспроизводства^1. На выбор того, что и сколько есть, влияет множество взаимодействующих факторов, связанных с внутренним состоянием животного, таких как уровень сытости, и условия окружающей среды, такие как^{качество продуктов питания 2,3,4,5.} Белок и углеводы являются двумя основными макроэлементами, и их сбалансированное потребление имеет важное значение для поддержания физиологических процессов животных. Таким образом, понимание нейронных механизмов, контролирующих поведение кормления и поддержания сбалансированного потребления этих макроэлементов является чрезвычайно актуальным. Это потому, что черты истории жизни, как продолжительность жизни, плодовитость, и метаболическое^{здоровье непосредственно зависит от уровня потребления белка 6,7,8,9,10}.

Использование более простых более урочищенные организмы, которые демонстрируют эволюционно сохраненные привычки кормления со сложными животными, в том числе млекопитающих, имеет важное значение для этого типа исследований. Важно отметить, что эти более простые модели животных дают хорошую возможность для вскрытия сложных биологических вопросов в дорогостоящем, этически и технически более эффективном контексте. В последние десятилетия, Drosophila, с его мощным генетическим инструментарием, сложные и стереотипное поведение и сохраненной архитектуры периферических и питательных механизмов зондирования с млекопитающими, была плодотворной моделью для поведенческих нейробиологов¹¹. В конечном счете, надежда заключается в том, что, понимая, как потребление пищи регулируется в этом животном, с более простой нервной системы, мы можем начать распутать нейрональных неисправностей, лежащих в основе расстройства пищевого поведения человека.

Изучение нейрональных субстратов для кормления поведения глубоко зависит от возможности одновременно измерять потребление пищи животными при манипулировании их нейрональной активностью. Из-за минимального количества пищи попадает, количественное количество пищи, съеденной мухами является чрезвычайно сложной задачей, и все методы в настоящее время имеются в настоящее время представляют значительные ограничения. Таким образом, золотой стандарт заключается в использовании комбинации дополнительных методологий¹². Взрослые мухи исторически благоприятствования в качестве генетической и поведенческой модели. Тем не менее, личинки дрозофилы, также предлагают возможности для исследования нейрональных субстратов, кодирующих поведение кормления. Личиновала центральной нервной системы (ЦНС), около 12000 нейронов, значительно менее сложным, чем у взрослых, который содержит около 150000 нейронов. Эта более низкая сложность не только численная, но и функциональная, так как личинонное поведение зависит от более простых локомотивных функций и сенсорных систем. Несмотря на кажущуюся простоту их нервной системы, личинки по-прежнему демонстрируют полное поведение кормления, и некоторые методы количественного приема пищи в личинках дрозофилы^{были описаны 5,13,14,15}. Спаривая с манипуляциями нейронной активности, личинки дрозофилы могут представлять собой очень урочиваемую модель для понимания нервной регуляции потребления пищи.

Здесь представлен подробный протокол количественной оценки потребления пищи личинками, подвергаемыми воздействию диет различного макроэлементного качества. Диеты, так называемые макроэлементные балансирующие диеты, отличались содержанием белков и углеводов, в частности, в отношении соотношения белка к углеводам (P:C) 1:1 (богатая белком диета), 1:4 (промежуточная диета) и 1:16 (плохое питание с белками), как показано на рисунке 1A. Кратко, количественный не-выбор кормления анализ был создан с использованием этих трех изокалорических сахарозы-дрожжи (SY) на основе диеты окрашены с синим красителем пищи. Поскольку экстракт дрожжей и сахароза были использованы в качестве белковых и углеводных источников, и оба содержат углеводы, изменение в соотношении P:C было получено путем изменения баланса этих двух компонентов, как ранее^{описано 16} и, как указано на рисунке 1B. Схематический обзор протокола, показывающий основные экспериментальные этапы, доступен на рисунке 2.

Этот протокол был создан с целью изучения роли конкретных популяций нейронов на регулирование уровней кормления личинок в диетах различных соотношений P:C и в контексте термогенетического нейронального экрана. Хорошо охарактеризованный нейрогенетический инструмент был использован из семьи Transient Receptor Potential (TRP) : Drosophila Transient Receptor Potential channel (dTRPA1), который является температурным и напряжением закрытым каналом катиона, позволяющим стрелять потенциалами действия, когда температура окружающей среды поднимается выше 25^{градусов по Цельсию 17.} Чтобы выразить dTRPA1 трансген, мы воспользовались Gal4 линий, основанных на cis-регулятивных регионах из генома Drosophila, созданный в лаборатории Рубин, в контексте проекта FlyLight в Janelia Research Campus^18,19.

Хотя протокол, здесь описано, был создан в контексте экрана активации, он может быть легко адаптирован экспериментатором к другим конкретным потребностям или интересам, а именно для выполнения подавления экрана с использованием температуры чувствительных нейронов глушитель ShibireTS²⁰, в качестве альтернативы dTRPA1. Эта и другие адаптации обсуждаются в разделах протокола и обсуждения.