Quantificazione dell'assunzione di macronutrienti in uno schermo neuronale termogenetico usando larve di Drosophila

Tutti gli animali dipendono da una dieta equilibrata per acquisire le quantità necessarie di nutrienti per la sopravvivenza, la crescita e la riproduzione¹. La scelta di cosa e quanto mangiare è influenzata da una moltitudine di fattori interagenti legati allo stato interno dell’animale, come il livello di sazietà, e le condizioni ambientali, come la qualità del^{cibo 2,3,4,5}. Proteine e carboidrati sono due dei principali macronutrienti e il suo apporto equilibrato è essenziale per sostenere i processi fisiologici degli animali. Pertanto, la comprensione dei meccanismi neurali che controllano i comportamenti di alimentazione e sostengono un’assunzione equilibrata di questi macronutrienti è estremamente rilevante. Questo perché i tratti della storia della vita come la durata della vita, la fecondità e la salute metabolica sono direttamente influenzati dai livelli di assunzione di proteine^6,7,8,9,10.

L’uso di organismi più semplici e trattabili che mostrano abitudini alimentari evolutivamente conservate con animali complessi, compresi i mammiferi, è essenziale per questo tipo di studi. È importante sottolineare che questi modelli animali più semplici offrono una buona opportunità per sezionare complesse questioni biologiche in un contesto costoso, eticamente e tecnicamente più efficace. Negli ultimi decenni, Drosophila, conil suo potente toolkit genetico, il comportamento intricato e stereotipato e l’architettura conservata dei meccanismi periferici e di rilevamento dei nutrienti con i mammiferi, è stato un modello fruttuoso per i neurobiologi comportamentali¹¹. In definitiva, la speranza è che comprendendo come l’assunzione di cibo sia regolata in questo animale, con un sistema nervoso più semplice, possiamo quindi iniziare a districare i malfunzionamenti neuronali alla base dei disturbi alimentari umani.

Lo studio dei substrati neuronali per i comportamenti di alimentazione dipende profondamente dalla capacità di misurare contemporaneamente l’assunzione di cibo degli animali manipolando la loro attività neuronale. A causa delle quantità minime di cibo ingerito, quantificare la quantità di cibo mangiato dalle mosche è estremamente impegnativo e tutti i metodi attualmente disponibili presentano limitazioni significative. Pertanto, il gold standard è quello di utilizzare una combinazione di metodologie complementari¹². Le mosche adulte sono state storicamente favorite come modello genetico e comportamentale. Tuttavia, le larve di Drosophila offrono anche l’opportunità di indagare i substrati neuronali che codificano il comportamento di alimentazione. Il sistema nervoso centrale larvale (SNC), con circa 12.000 neuroni, è significativamente meno complesso di quello dell’adulto, che contiene circa 150.000 neuroni. Questa minore complessità non è solo numerica ma anche funzionale, poiché i comportamenti larvali si basano su funzioni locomotiva più semplici e sistemi sensoriali. Nonostante l’apparente semplicità del loro sistema nervoso, le larve mostrano ancora comportamenti di alimentazione completi e alcuni metodi per quantificare l’ingestione di cibo nelle larve di Drosophila sono stati^{descritti 5,13,14,15}. Abbinandosi a manipolazioni dell’attività neuronale, le larve di Drosophila possono costituire un modello altamente trattabile per comprendere la regolazione neurale dell’assunzione di cibo.

Fornito qui è un protocollo dettagliato per quantificare l’assunzione di cibo nelle larve esposte a diete di diversa qualità macronutriente. Le diete, le cosiddette diete equilibranti macronutrienti, differivano nel contenuto di proteine e carboidrati, in particolare per quanto riguarda i rapporti proteina-carboidrati (P:C): 1:1 (dieta ricca di proteine), 1:4 (dieta intermedia) e 1:16 (dieta povera di proteine), come mostrato nella figura 1A. In breve, è stato stabilito un saggio quantitativo di alimentazione senza scelta utilizzando queste tre diete a base di lievito di saccarosio isocalorico (SY) tinte con un colorante alimentare blu. Poiché l’estratto di lievito e il saccarosio sono stati utilizzati come fonti proteiche e di carboidrati ed entrambi contengono carboidrati, la variazione dei rapporti P:C è stata ottenuta modificando l’equilibrio di questi due componenti, come descritto in^{precedenza 16} e come indicato nella figura 1B. Una panoramica schematica del protocollo, che mostra i principali passaggi sperimentali, è disponibile nella figura 2.

Questo protocollo è stato stabilito con l’obiettivo di indagare il ruolo di specifiche popolazioni neuronali sulla regolazione dei livelli di alimentazione larvale nelle diete di diversi rapporti P:C e nel contesto di uno schermo neuronale termogenetico. Uno strumento neurogenetico ben caratterizzato è stato utilizzato dalla famiglia TRP (Transient Receptor Potential): Drosophila Transient Receptor Potential channel (dTRPA1), che è un canale di temperatura e tensione-gated, consentendo la cottura di potenziali d’azione quando le temperature ambientali salgono sopra i 25 °C¹⁷. Per esprimere il transgene dTRPA1, abbiamo sfruttato le linee Gal4 basate sulle regioni regolatorie cisdel genoma drosophila, stabilite nel laboratorio Rubin, nell’ambito del progetto FlyLight presso Janelia Research Campus^18,19.

Sebbene il protocollo, qui descritto, sia stato stabilito nel contesto di una schermata di attivazione, può essere facilmente adattato dallo sperimentatore ad altre esigenze o interessi specifici, vale a dire eseguire uno schermo di soppressione utilizzando il silenziatore neuronale sensibile alla temperatura ShibireTS²⁰, in alternativa a dTRPA1. Questo e altri adattamenti sono discussi nelle sezioni relative al protocollo e alle discussioni.