القياس الكمي لمدون المغذيات الكبيرة في شاشة عصبية حرارية جينية باستخدام يرقات دروسوفيلا
Summary
الموصوف هنا هو بروتوكول يمكن من القياس الكمي اللوني لكمية الطعام التي تؤكل في غضون فترة زمنية محددة من قبل يرقات Drosophila melanogaster المعرضة لأنظمة غذائية ذات جودة مختلفة من المغذيات الكبيرة. يتم إجراء هذه المقايسات في سياق شاشة عصبية حرارية.
Abstract
تسمح سلوكيات الأعلاف والتغذية للحيوانات بالوصول إلى مصادر الطاقة والمواد المغذية الضرورية لتطورها وصحتها وملاءمتها البدنية. التحقيق في تنظيم الخلايا العصبية من هذه السلوكيات أمر ضروري لفهم الآليات الفسيولوجية والجزيئية الكامنة وراء التوازن الغذائي. إن استخدام نماذج حيوانية قابلة للسحب وراثيا مثل الديدان والذباب والأسماك يسهل إلى حد كبير هذه الأنواع من الدراسات. في العقد الماضي، ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster وقد استخدمت كنموذج قوي من قبل علماء الأعصاب التحقيق في السيطرة العصبية من التغذية وسلوكيات الأعلاف. في حين أن قيمة بلا شك، معظم الدراسات دراسة الذباب الكبار. هنا ، نصف بروتوكولا يستفيد من الجهاز العصبي اليرقات الأبسط للتحقيق في الركائز العصبية التي تتحكم في سلوكيات التغذية عندما تتعرض اليرقات للوجبات الغذائية المختلفة في محتواها من البروتين والكربوهيدرات. تستند أساليبنا على فحص التغذية الكمي الملون بدون اختيار ، الذي يتم إجراؤه في سياق شاشة تنشيط حراري عصبي. كمقروءة ، تم استخدام كمية الطعام التي تأكلها اليرقات على مدى فترة ساعة واحدة عند التعرض لأحد الوجبات الغذائية الثلاثة المسماة بالصبغة التي تختلف في نسب البروتين إلى الكربوهيدرات (P:C). ويتضح فعالية هذا البروتوكول في سياق شاشة عصبية جينية في Drosophilaاليرقات , من خلال تحديد المجموعات العصبية المرشح تنظيم كمية الطعام تؤكل في الوجبات الغذائية من نوعية المغذيات الكبيرة المختلفة. كما تمكنا من تصنيف وتجميع الأنماط الجينية التي تم اختبارها في فصول فينوتبيك. وإلى جانب استعراض موجز للأساليب المتاحة حاليا في المؤلفات، تناقش مزايا هذه الأساليب وحدودها، كما تقدم بعض الاقتراحات بشأن كيفية تكييف هذا البروتوكول مع تجارب محددة أخرى.
Introduction
تعتمد جميع الحيوانات على نظام غذائي متوازن للحصول على الكميات الضرورية من المواد الغذائية للبقاء والنمو والتكاثر1. يتأثر اختيار ما وكمية الطعام بالعديد من العوامل المتفاعلة المتعلقة بحالة الحيوان الداخلية ، مثل مستوى الشبع ، والظروف البيئية ، مثل جودة الطعام2و3و 4و5. البروتين والكربوهيدرات هما المغذيات الكبيرة الرئيسية وتناولها متوازن ضروري للحفاظ على العمليات الفسيولوجية للحيوانات. لذلك ، فإن فهم الآليات العصبية التي تتحكم في سلوكيات التغذية والحفاظ على كمية متوازنة من هذه المغذيات الكبيرة أمر وثيق الصلة للغاية. وذلك لأن سمات تاريخ الحياة مثل العمر، والبراز، والصحة الأيضية تتأثر مباشرة بمستويات تناول البروتين6،7،8،9،10.
إن استخدام كائنات أبسط أكثر قابلية للسحب تظهر عادات تغذية محفوظة تطوريا مع الحيوانات المعقدة، بما في ذلك الثدييات، أمر ضروري لهذا النوع من الدراسات. والأهم من ذلك أن هذه النماذج الحيوانية الأبسط توفر فرصة جيدة لتشريح الأسئلة البيولوجية المعقدة في سياق مكلف وأخلاقي وتقني أكثر فعالية. في العقود الأخيرة ، كان Drosophila، مع مجموعة أدواته الجينية القوية ، والسلوك المعقد والنمطي والهندسة المعمارية المحفوظة لآليات استشعار المحيطية والمغذيات مع الثدييات ، نموذجا مثمرا لعلماء الأعصاب السلوكية11. في نهاية المطاف ، والأمل هو أنه من خلال فهم كيفية تنظيم تناول الطعام في هذا الحيوان ، مع أبسط جهاز عصبي ، يمكننا بعد ذلك البدء في فك الأعطال العصبية الكامنة وراء اضطرابات الأكل البشرية.
تعتمد دراسة الركائز العصبية لسلوكيات التغذية بشكل عميق على القدرة على قياس تناول الحيوانات الغذائي في وقت واحد مع التلاعب بنشاطها العصبي. نظرا للكميات الدنيا من الطعام الذي يتم تناوله ، فإن تحديد كمية الطعام الذي يأكله الذباب أمر صعب للغاية ، وجميع الطرق المتاحة حاليا تمثل قيودا كبيرة. وبالتالي ، فإن معيار الذهب هو استخدام مزيج من المنهجيات التكميلية12. الذباب البالغ كان مفضلا تاريخيا كنموذج وراثي وسلوكي. ومع ذلك ، تقدم يرقات Drosophila أيضا فرصا للتحقيق في الركائز العصبية التي ترميز سلوك التغذية. الجهاز العصبي المركزي اليرقات (CNS)، مع حوالي 12،000 الخلايا العصبية، هو أقل تعقيدا بكثير من الكبار، الذي يحتوي على ما يقرب من 150،000 الخلايا العصبية. هذا التعقيد الأدنى ليس فقط عدديا ولكنه وظيفي أيضا ، نظرا لأن سلوكيات اليرقات تعتمد على وظائف قاطرة أبسط وأنظمة حسية. على الرغم من البساطة الواضحة لأنظمتها العصبية ، لا تزال اليرقات تظهرسلوكياتتغذية كاملة ، وقد تم وصف بعض الطرق لقياس ابتلاع الطعام في يرقات Drosophila 5و13و14و15. من خلال الاقتران مع التلاعب في نشاط الخلايا العصبية ، يمكن أن تشكل يرقات Drosophila نموذجا قابلا للسحب للغاية لفهم التنظيم العصبي لتناول الطعام.
يقدم هنا بروتوكول مفصل لتحديد كمية تناول الطعام في اليرقات المعرضة لأنظمة غذائية ذات جودة مغذيات كبيرة مختلفة. اختلفت الوجبات الغذائية، التي تسمى الوجبات الغذائية لتحقيق التوازن بين المغذيات الكبيرة، في محتويات البروتين والكربوهيدرات، وتحديدا فيما يتعلق بنسب البروتين إلى الكربوهيدرات (P:C): 1:1 (النظام الغذائي الغني بالبروتين)، و 1:4 (النظام الغذائي المتوسط)، و 1:16 (النظام الغذائي الفقير بالبروتين)، كما هو موضح في الشكل 1A. باختصار، تم إنشاء فحص التغذية الكمي بدون خيار باستخدام هذه الوجبات الغذائية الثلاثة القائمة على السكروز (SY) المصبوغة بصبغة غذائية زرقاء. لأن استخراج الخميرة والسكروز كانت تستخدم كمصادر البروتين والكربوهيدرات، وكلاهما يحتوي على الكربوهيدرات، تم الحصول على الاختلاف في نسب P:C عن طريق تغيير توازن هذين العنصرين، كما هو موضح سابقا16 وكما هو مبين في الشكل 1B. تتوفر نظرة عامة تخطيطية للبروتوكول، تظهر الخطوات التجريبية الرئيسية، في الشكل 2.
تم إنشاء هذا البروتوكول بهدف التحقيق في دور مجموعات معينة من الخلايا العصبية على تنظيم مستويات تغذية اليرقات في الوجبات الغذائية ذات نسب P:C المختلفة وفي سياق شاشة الخلايا العصبية الحرارية. تم استخدام أداة عصبية وراثية تتميز بشكل جيد من عائلة إمكانات المستقبلات العابرة (TRP): قناة Drosophila Transient Receptor Potential (dTRPA1) ، وهي قناة تسيؤ ذات درجة حرارة وبطرة ، مما يسمح بإطلاق إمكانات العمل عندما ترتفع درجات الحرارة المحيطة فوق 25 درجة مئوية17. للتعبير عن تحويل dTRPA1 ، استفدنا من خطوط Gal4 القائمة على المناطق التنظيمية لرابطة الدول المستقلةمن جينوم Drosophila ، الذي أنشئ في مختبر روبن ، في سياق مشروع FlyLight في حرم أبحاث Janelia18،19.
على الرغم من أن البروتوكول، هنا وصفها، وقد أنشئت في سياق شاشة التنشيط، فإنه يمكن تكييفها بسهولة من قبل المجرب لاحتياجات محددة أخرى أو المصالح، وهي لأداء شاشة قمع باستخدام حساسة لدرجة الحرارة الخلايا العصبية كاتم الصوت ShibireTS20،بدلا من dTRPA1. وتناقش هذه المواءمة وغيرها في أقسام البروتوكول والمناقشة.
Protocol
Representative Results
Discussion
مع هذا البروتوكول ، يمكن للمرء اختبار قدرة اليرقات تحت تنشيط الخلايا العصبية الحرارية المحددة لتنظيم مستويات تناول البروتين والكربوهيدرات ، وهما مغذيات كبيرة ، عندما تتعرض لوجبات غذائية ذات تكوين P:C مختلف. تم اختبار هذه الطريقة في سياق الفحص الأولي لليرقات بهدف تحديد مجموعات الخلايا الع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر معهد غولبنكيان دي سينسيا على إتاحة إمكانية الوصول إلى جزء من المعدات التجريبية الموصوفة في هذا البروتوكول. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة البرتغالية للعلوم والتكنولوجيا (FCT)، LISBOA-01-0145-FEDER-007660، PTDC/NEU- NMC/2459/2014، IF/00697/2014 وLa Caixa HR17-00595 إلى PMD وزمالة مستقبلية لمجلس البحوث الأسترالي (FT170100259) إلى CKM.
Materials
| 1.5 mL microtubes | Sarstedt AG & Co. | 72.690.001 | |
| 10xPBS | Nytech | MB18201 | |
| 2.0 mL microtubes | Sarstedt AG & Co. | 72.695.500 | |
| 60 mm petri dishes | Greiner Bio-one, Austria | 628161 | |
| 96 well microplates | Santa Cruz Biotechnology | SC-204453 | |
| Agar | Pró-vida, Portugal | ||
| Bench cooler | Nalgene, USA | Labtop Cooler 5115-0032 | |
| Blue food dye | Rayner, Billingshurst, UK | ||
| Cell disruption media | Scientific Industries, Inc. | 888-850-6208 | (0.5 mm glass beads) |
| Dish weight boats | Santa Cruz Biotechnology | SC-201606 | |
| Embryo collection cage for 60 mm petri dishes | Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK | FLY1212 (59-100) | |
| Featherweight forceps | BioQuip Products, USA | 4750 | |
| Fly food for stocks maintenance | 1 L food contains: 10 g Agar, 100 g Yeast Extract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionic acid | ||
| Forceps #5 | Dumont | 0108-5-PS | Standard tips, INOX, 11cm |
| Incubator | LMS Ltd, UK | Series 2, Model 230 | For thermogenetic feeding assay (30∘C) |
| Incubator | Percival Scientific, USA | DR36NL | To stage larvae (19∘C) |
| Janelia lines | Janelia Research Campus | Detailed information in Table 2 | |
| Macronutrient balancing diets | Composition and nutritional information in Figure 1 | ||
| Methanol | VWR | CAS number: 67-56-1 | |
| Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Nitrile gloves | VWR, USA | ||
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | 5804 R / Serial number: 5805CI364293 | |
| Rubin Gal4 ines | Janelia Research Campus | Stoks available at Bloomington Drosophila Stock Center | |
| ShibireTS UAS line | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC number: 66600 | Provided by Carlos Ribeiro Group |
| Soft brushes | For sorting anaesthetised fruit flies | ||
| Spectrophotometer plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan Go 51119300 | |
| Stereo microscope | Nikon | 1016625 | |
| Sucrose | Sidul, Portugal | ||
| Third-instar larvae (L3) rearing diet | Composition and nutritional information in Figure 1 | ||
| Timer | |||
| Tissue lyzer / bead beater | MP Biomedicals, USA | FastPrep-24 6004500 | |
| TRPA1 UAS line | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC number: 26264 | Expresses TrpA1 under UAS control; may be used to activate neurons experimentally at 25 ∘C |
| Water bath | Sheldon Manufacturing Inc., USA | W20M-2 / 03068308 / 9021195 | |
| Yeast extract | Pró-vida, Portugal | 51% Protein, 15% Carbohydrate |
References
- Raubenheimer, D. . Nature of nutrition – a unifying framework from animal adaptation to human. , (2012).
- Carvahlo, M. J. a., Mirth, C. K. Coordinating morphology with behavior during development: an integrative approach from a fly perspective. Frontiers in Ecology and Evolution. , (2015).
- Steck, K., et al. Internal amino acid state modulates yeast taste neurons to support protein homeostasis in Drosophila. Elife. 7, 31625 (2018).
- Itskov, P. M., Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Frontiers in Neuroscience. 7, 12 (2013).
- Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
- Grandison, R. C., Piper, M. D., Partridge, L. Amino-acid imbalance explains extension of lifespan by dietary restriction in Drosophila. Nature. 462 (7276), 1061-1064 (2009).
- Lee, K. P., et al. Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2498-2503 (2008).
- Levine, M. E., et al. Low protein intake is associated with a major reduction in IGF-1, cancer, and overall mortality in the 65 and younger but not older population. Cell Metabolism. 19 (3), 407-417 (2014).
- Solon-Biet, S. M., et al. The ratio of macronutrients, not caloric intake, dictates cardiometabolic health, aging, and longevity in ad libitum-fed mice. Cell Metabolism. 19 (3), 418-430 (2014).
- Piper, M. D., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nature Methods. 11 (1), 100-105 (2014).
- Jones, W. D. The expanding reach of the GAL4/UAS system into the behavioral neurobiology of Drosophila. BMB Reports. 42 (11), 705-712 (2009).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Neckameyer, W. S. A trophic role for serotonin in the development of a simple feeding circuit. Developmental Neuroscience. 32 (3), 217-237 (2010).
- Gasque, G., Conway, S., Huang, J., Rao, Y., Vosshall, L. B. Small molecule drug screening in Drosophila identifies the 5HT2A receptor as a feeding modulation target. Scientific Reports. 3, (2013).
- Schoofs, A., et al. Selection of motor programs for suppressing food intake and inducing locomotion in the Drosophila brain. PLoS Biology. 12 (6), 1001893 (2014).
- Pocas, G. M., Crosbie, A. E., Mirth, C. K. When does diet matter? The roles of larval and adult nutrition in regulating adult size traits in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. , 104051 (2020).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Reports. 2 (4), 991-1001 (2012).
- Kitamoto, T. Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons. Journal of Neurobiology. 47 (2), 81-92 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Shirangi, T. R., Stern, D. L., Truman, J. W. Motor control of Drosophila courtship song. Cell Reports. 5 (3), 678-686 (2013).
- Mirth, C. M. J. Food intake and food choice are altered by the developmental transition at critical weight in Drosophila melanogaster. Animal Behaviour. 126, 195-208 (2017).
- Simpson, S. J., Raubenheimer, D. Obesity: the protein leverage hypothesis. Obesity Reviews. 6 (2), 133-142 (2005).
- Raubenheimer, D., Simpson, S. J. Integrative models of nutrient balancing: application to insects and vertebrates. Nutrition Research Reviews. 10 (1), 151-179 (1997).
- Li, H. H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Reports. 8 (3), 897-908 (2014).
- Bhatt, P. K., Neckameyer, W. S. Functional analysis of the larval feeding circuit in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (81), e51062 (2013).
- Wong, R., Piper, M. D. W., Blanc, E., Partridge, L. Pitfalls of measuring feeding rate in the fruit fly Drosophila melanogaster. Nature Methods. 5 (3), 214-215 (2008).
- Almeida-Carvalho, M. J., et al. The Ol1mpiad: concordance of behavioural faculties of stage 1 and stage 3 Drosophila larvae. Journal of Experimental Biology. 220, 2452-2475 (2017).
- Rodrigues, M. A., et al. Drosophila melanogaster larvae make nutritional choices that minimize developmental time. Journal of Insect Physiology. 81, 69-80 (2015).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), 6063 (2009).
- Wu, Q., et al. Developmental control of foraging and social behavior by the Drosophila neuropeptide Y-like system. Neuron. 39 (1), 147-161 (2003).
- Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13289-13294 (2005).
- Lingo, P. R., Zhao, Z., Shen, P. Co-regulation of cold-resistant food acquisition by insulin- and neuropeptide Y-like systems in Drosophila melanogaster. Neuroscience. 148 (2), 371-374 (2007).
