Imaging e analisi del trasporto neurofilamento nel nervo tibiale del topo escresato

Il trasporto assonale dei neurofilamenti è stato dimostrato per la prima volta negli anni ’70 mediante l’etichettatura radioisotopica a impulsi¹. Questo approccio ha prodotto una ricchezza di informazioni sul trasporto neurofilamento in vivo, ma ha una risoluzione spaziale e temporale relativamente bassa, in genere nell’ordine di millimetri e giorni al meglio². Inoltre, l’etichettatura radioisotopica degli impulsi è un approccio indiretto che richiede l’iniezione e il sacrificio di più animali per generare un singolo corso di tempo. Con la scoperta delle proteine fluorescenti e i progressi nella microscopia a fluorescenza negli anni ’90, è diventato successivamente possibile immagine del trasporto neurofilamento direttamente nei neuroni ri culture su una scala temporale di secondi o minuti e con risoluzione spaziale sub-micrometrica, offrendo una visione molto maggiore del meccanismo del movimento³. Questi studi hanno rivelato che i polimeri neurofilament negli assoni si muovono rapidamente e ad intermittenza sia in direzioni anterograde che retrograde lungo le tracce di microtubuli, spinte dalle proteine motorie dei microtubuli. Tuttavia, i neurofilamenti sono strutture limitate alla diffrazione di soli 10 nm di diametro che sono tipicamente distanziate dai loro vicini da solo decine di nanometri; pertanto, i polimeri possono essere tracciati solo in neuroni ri culture che contengono neurofilamenti scarsamente distribuiti in modo che i polimeri in movimento possano essere risolti dai loro vicini⁴. Pertanto, non è attualmente possibile tracciare singoli neurofilamenti in assoni che contengono abbondanti polimeri neurofilament, come gli assoni mielinati.

Per analizzare il trasporto assonale dei neurofilamenti in assoni ricchi di neurofilamenti utilizzando la microscopia a fluorescenza, usiamo un metodo di sfuggimento a impulsi di fotoattivazione fluorescenza che abbiamo sviluppato per studiare il comportamento di pausa a lungo termine dei neurofilamenti nelle cellule nervose^{pianate 4,5}. I neurofilamenti contrassegnati con una proteina di fusione del neurofilamento fluorescente fotoattivabile vengono attivati in un breve segmento di assone, e quindi il tasso di partenza di tali filamenti dalla regione attivata viene quantificato misurando il decadimento della fluorescenza nel tempo. Il vantaggio di questo approccio è che si tratta di un’analisi a livello di popolazione del trasporto neurofilamento che può essere applicata su una scala temporale di minuti o ore senza la necessità di monitorare il movimento dei singoli polimeri neurofilament. Ad esempio, abbiamo usato questo metodo per analizzare la cinetica del trasporto neurofilamento nelle culture mielinanti⁶.

Recentemente, abbiamo descritto lo sviluppo di un topo transgenico hThy1-paGFP-NFM che esprime bassi livelli di una proteina neurofilamento con tag paGFP M (paGFP-NFM) nei neuroni sotto il controllo del promotore Thy1 specifico del neurone^{umano 7}. Questo topo permette l’analisi del trasporto di neurofilamenti in situ utilizzando la microscopia a fluorescenza. In questo articolo, descriviamo gli approcci sperimentali per l’analisi del trasporto di neurofilamenti in assoni mielinati di nervi tibiali da questi topi utilizzando due approcci. Il primo di questi approcci è il metodo di fuga a impulsi descritto in precedenza. Questo metodo può generare informazioni sul comportamento di pausa dei neurofilamenti, ma è cieco alla direzione in cui i filamenti lasciano la regione attivata e pertanto non consente la misurazione della direzionalità netta e della velocità di^{trasporto 8}. Il secondo di questi approcci è un nuovo metodo di diffusione dell’impulso in cui analizziamo non solo la perdita di fluorescenza dalla regione attivata, ma anche l’aumento transitorio della fluorescenza in due finestre di fiancheggiamento attraverso le quali i filamenti fluorescenti si muovono mentre partono dalla regione attivata sia in direzioni anterograde che retrograde. In entrambi gli approcci, i parametri del trasporto neurofilamento come la velocità media, la direzionalità netta e il comportamento di pausa possono essere ottenuti utilizzando l’analisi matematica e la modellazione dei cambiamenti nella fluorescenza nelle finestre di misurazione. Figura 3 illustra questi due approcci.

Questo protocollo dimostra la dissezione e la preparazione del nervo, l’attivazione e l’imaging della fluorescenza paGFP e la quantificazione del trasporto neurofilamento dalle immagini acquisite utilizzando il pacchetto di distribuzione FIJI di ImageJ⁹. Usiamo il nervo tibiale perché è lungo (diversi cm) e non si ramifica; tuttavia, in linea di principio qualsiasi nervo che esprime paGFP-NFM è appropriato per l’uso con questa tecnica se può essere sezionato e de-tireggiato senza danneggiare gli assoni.