Imágenes y análisis del transporte de neurofilamento en el nervio tibial de ratón extirpado

El transporte axonal de neurofilamentos se demostró por primera vez en la década de 1970 mediante el etiquetado de pulsos radioisotópicos^1. Este enfoque ha producido una gran cantidad de información sobre el transporte de neurofilamento in vivo,pero tiene una resolución espacial y temporal relativamente baja, típicamente en el orden de milímetros y días en el mejor^2. Además, el etiquetado por pulsos radioisópicos es un enfoque indirecto que requiere la inyección y el sacrificio de múltiples animales para generar un solo curso de tiempo. Con el descubrimiento de proteínas fluorescentes y los avances en la microscopía de fluorescencia en la década de 1990, posteriormente se hizo posible imaginar el transporte de neurofilamento directamente en las neuronas cultivadas en una escala de tiempo de segundos o minutos y con resolución espacial subcrómetro, lo que ofrece una visión mucho mayor del mecanismo de movimiento³. Estos estudios han revelado que los polímeros de neurofilamento en los axones se mueven rápida e intermitentemente en direcciones anterogradas y retrógradas a lo largo de las vías de los microtúbulos, propulsados por proteínas del motor de microtúbulos. Sin embargo, los neurofilamentos son estructuras limitadas por difracción de sólo 10 nm de diámetro que normalmente están espaciadas aparte de sus vecinos por sólo decenas de nanómetros; por lo tanto, los polímeros sólo pueden ser rastreados en neuronas cultivadas que contienen neurofilamentos escasamente distribuidos para que los polímeros en movimiento puedan ser resueltos de sus vecinos⁴. Por lo tanto, actualmente no es posible rastrear neurofilamentos individuales en axones que contienen abundantes polímeros de neurofilamento, como axones mielinados.

Para analizar el transporte axonal de neurofilamentos en axones ricos en neurofilamento utilizando microscopía de fluorescencia, utilizamos un método de fotoactivación de fluorescencia de pulso-escape que desarrollamos para estudiar el comportamiento pausador a largo plazo de los neurofilamentos en las células nerviosas cultivadas^4,,5. Los neurofilamentos etiquetados con una proteína de fusión de neurofilamento fluorescente fotoactivable se activan en un segmento corto de axón, y luego la velocidad de salida de esos filamentos de la región activada se cuantifica midiendo la descomposición de la fluorescencia con el tiempo. La ventaja de este enfoque es que es un análisis a nivel de población del transporte de neurofilamento que se puede aplicar en una escala de tiempo de minutos u horas sin la necesidad de rastrear el movimiento de polímeros de neurofilamento individuales. Por ejemplo, hemos utilizado este método para analizar la cinética del transporte de neurofilamento en cultivos mielizantes⁶.

Recientemente, describimos el desarrollo de un ratón transgénico hThy1-paGFP-NFM que expresa bajos niveles de una proteína de neurofilamento etiquetada con paGFP M (paGFP-NFM) en las neuronas bajo el control del promotor Thy1 específico de la neurona humana⁷. Este ratón permite el análisis del transporte de neurofilamento in situ utilizando microscopía de fluorescencia. En este artículo, describimos los enfoques experimentales para analizar el transporte de neurofilamento en axones mielinados de nervios tibiales de estos ratones utilizando dos enfoques. El primero de estos enfoques es el método de escape de pulsos descrito anteriormente. Este método puede generar información sobre el comportamiento de pausa de los neurofilamentos, pero es ciego a la dirección en la que los filamentos salen de la región activada, y por lo tanto no permite la medición de la direccionalidad de la red y la velocidad de transporte⁸. El segundo de estos enfoques es un nuevo método de propagación de pulsos en el que analizamos no sólo la pérdida de fluorescencia de la región activada, sino también el aumento transitorio de la fluorescencia en dos ventanas de flanqueo a través de las cuales los filamentos fluorescentes se mueven a medida que salen de la región activada tanto en direcciones anterogradas como retrógradas. En ambos enfoques, se pueden obtener parámetros de transporte de neurofilamento como la velocidad media, la direccionalidad de la red y el comportamiento de pausa mediante el análisis matemático y el modelado de los cambios en la fluorescencia en las ventanas de medición. La Figura 3 ilustra estos dos enfoques.

Este protocolo demuestra la disección y preparación del nervio, la activación y la toma de imágenes de la fluorescencia paGFP, y la cuantificación del transporte de neurofilamento a partir de las imágenes adquiridas utilizando el paquete de distribución FIJI de ImageJ⁹. Usamos el nervio tibial porque es largo (varios cm) y no se ramifica; sin embargo, en principio cualquier nervio que exprese paGFP-NFM es apropiado para su uso con esta técnica si puede ser diseccionado y desenvado sin dañar los axones.