Bildgebung und Analyse des Neurofilamenttransports in verbraucheten Maus-Tibialnerv

Der axonale Transport von Neurofilamenten wurde erstmals in den 1970er Jahren durch radioisotopische Pulsbeschriftung¹demonstriert. Dieser Ansatz hat eine Fülle von Informationen über Neurofilament-Transport in vivoergeben, aber es hat relativ geringe räumliche und zeitliche Auflösung, in der Regel in der Größenordnung von Millimetern und Tagen bestenfalls². Darüber hinaus ist die radioisotopen pulsierende Kennzeichnung ein indirekter Ansatz, der die Injektion und das Opfer mehrerer Tiere erfordert, um einen einzigen Zeitverlauf zu erzeugen. Mit der Entdeckung fluoreszierender Proteine und Fortschritten in der Fluoreszenzmikroskopie in den 1990er Jahren wurde es später möglich, neurofilamenten Transport direkt in kultivierten Neuronen auf einer Zeitskala von Sekunden oder Minuten und mit Submikrometer räumlicher Auflösung abzubilden, was einen viel größeren Einblick in den Mechanismus der Bewegung³ermöglichte. Diese Studien haben gezeigt, dass Neurofilamentpolymere in Axonen sich sowohl in anterograde als auch in retrograde Richtungen entlang von Mikrotubulispuren, angetrieben von mikrotubule motorischen Proteinen, schnell und intermittierend bewegen. Neurofilamente sind jedoch beugungsbegrenzte Strukturen mit einem Durchmesser von nur 10 nm, die in der Regel nur um zig Nanometer von ihren Nachbarn entfernt sind; Daher können die Polymere nur in kultivierten Neuronen verfolgt werden, die dünn verteilte Neurofilamente enthalten, so dass die beweglichen Polymere von ihren Nachbarn gelöst werden können⁴. Daher ist es derzeit nicht möglich, einzelne Neurofilamente in Axonen zu verfolgen, die reichlich Neurofilamentpolymere enthalten, wie z. B. myelinierte Axone.

Um den axonalen Transport von Neurofilamenten in neurofilamentreichen Axonen mittels Fluoreszenzmikroskopie zu analysieren, verwenden wir eine fluoreszenz-Photoaktivierungs-Puls-Escape-Methode, die wir entwickelt haben, um das langfristige Pausungsverhalten von Neurofilamenten in kultivierten Nervenzellen^4,5zu untersuchen. Neurofilamente, die mit einem photoaktivierbaren fluoreszierenden Neurofilament-Fusionsprotein markiert sind, werden in einem kurzen Segment von Axon aktiviert, und dann wird die Abflugrate dieser Filamente aus der aktivierten Region durch Messung des Fluoreszenzzerfalls im Laufe der Zeit quantifiziert. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es sich um eine Populations-Level-Analyse des Neurofilamenttransports handelt, die auf einer Zeitskala von Minuten oder Stunden angewendet werden kann, ohne die Bewegung einzelner Neurofilamentpolymere verfolgen zu müssen. Zum Beispiel haben wir diese Methode verwendet, um die Kinetik des Neurofilamenttransports in myelinierenden Kulturen zu analysieren⁶.

Kürzlich beschrieben wir die Entwicklung einer hThy1-paGFP-NFM transgenen Maus, die niedrige Konzentrationen eines paGFP-markierten Neurofilament-Proteins M (paGFP-NFM) in Neuronen unter der Kontrolle des menschlichen neuronspezifischen Thy1-Promotors⁷ausdrückt. Diese Maus ermöglicht die Analyse des Neurofilamenttransports in situ mittels Fluoreszenzmikroskopie. In diesem Artikel beschreiben wir die experimentellen Ansätze zur Analyse des Neurofilamenttransports in myelinierten Axonen von tibiaellen Nerven von diesen Mäusen mit zwei Ansätzen. Der erste dieser Ansätze ist die oben beschriebene Puls-Escape-Methode. Diese Methode kann Informationen über das Pausungsverhalten der Neurofilamente generieren, ist aber blind für die Richtung, in der die Filamente den aktivierten Bereich abfahren, und erlaubt daher keine Messung der Nettorichtung und Transportgeschwindigkeit⁸. Der zweite dieser Ansätze ist eine neue Puls-Spread-Methode, bei der wir nicht nur den Verlust der Fluoreszenz aus der aktivierten Region analysieren, sondern auch die vorübergehende Zunahme der Fluoreszenz in zwei flankierenden Fenstern, durch die sich die fluoreszierenden Filamente bewegen, während sie den aktivierten Bereich sowohl anterograde als auch retrograde Richtungen ablassen. In beiden Ansätzen können Parameter des Neurofilamenttransports wie Durchschnittsgeschwindigkeit, Nettorichtungund Pausierungsverhalten durch mathematische Analyse und Modellierung der Fluoreszenzveränderungen in den Messfenstern ermittelt werden. Abbildung 3 zeigt diese beiden Ansätze.

Dieses Protokoll demonstriert die Zerlegung und Vorbereitung des Nervs, Aktivierung und Bildgebung der paGFP Fluoreszenz, und Quantifizierung des Neurofilament-Transports aus den erfassten Bildern mit dem FIJI-Verteilungspaket von ImageJ⁹. Wir verwenden den Tibianerv, weil er lang ist (mehrere cm) und nicht verzweigt; Grundsätzlich ist jedoch jeder Nervenausdruck paGFP-NFM für die Verwendung mit dieser Technik geeignet, wenn es seziert und entmantelt werden kann, ohne die Axone zu beschädigen.