Beeldvorming en analyse van neurofilament transport in accijnzen muis tibial zenuw

Het axonale transport van neurofilamenten werd voor het eerst gedemonstreerd in de jaren 1970 door radio-isotopen pulse-labeling¹. Deze aanpak heeft een schat aan informatie opgeleverd over neurofilament transport in vivo, maar het heeft een relatief lage ruimtelijke en temporele resolutie, meestal in de orde van millimeters en dagen op zijn best². Bovendien is radio-isotopenpulslabeling een indirecte benadering die de injectie en het offer van meerdere dieren vereist om een eenmalige cursus te genereren. Met de ontdekking van fluorescerende eiwitten en vooruitgang in fluorescentiemicroscopie in de jaren 1990, werd het vervolgens mogelijk om neurofilament transport direct in gekweekte neuronen beeld op een tijdschaal van seconden of minuten en met sub-micrometer ruimtelijke resolutie, waardoor veel meer inzicht in het mechanisme van beweging³. Deze studies hebben aangetoond dat neurofilament polymeren in axonen snel en met tussenpozen bewegen in zowel anterograde als retrograde richtingen langs microtubulisporen, aangedreven door microtubuli motorische eiwitten. Echter, neurofilamenten zijn diffractie-beperkte structuren slechts 10 nm in diameter die meestal zijn verdeeld afgezien van hun buren door slechts tientallen nanometer; daarom kunnen de polymeren alleen worden gevolgd in gekweekte neuronen die schaars verdeelde neurofilamenten bevatten, zodat de bewegende polymeren kunnen worden opgelost van hun buren⁴. Zo is het momenteel niet mogelijk om enkele neurofilamenten in axonen te volgen die overvloedige neurofilament polymeren bevatten, zoals gesedineerde axonen.

Om het axale transport van neurofilamenten in neurofilamentrijke axonen te analyseren met behulp van fluorescentiemicroscopie, gebruiken we een fluorescentie fotoactivatie pulse-escape methode die we ontwikkelden om het langdurige pauzegedrag van neurofilamenten in gekweekte zenuwcellen^4,5te bestuderen. Neurofilamenten gelabeld met een fotoactivatable fluorescerende neurofilament fusie-eiwit worden geactiveerd in een kort segment van axon, en vervolgens wordt de snelheid van vertrek van die filamenten uit het geactiveerde gebied gekwantificeerd door het fluorescentieverval in de loop van de tijd te meten. Het voordeel van deze aanpak is dat het een populatie-niveau analyse van neurofilament transport dat kan worden toegepast op een tijdschaal van minuten of uren zonder de noodzaak om de beweging van individuele neurofilament polymeren volgen. We hebben deze methode bijvoorbeeld gebruikt om de kinetiek van neurofilamenttransport in myelineculturen te analyseren^6.

Onlangs hebben we beschreven de ontwikkeling van een hThy1-paGFP-NFM transgene muis die lage niveaus van een paGFP-tagged neurofilament eiwit M (paGFP-NFM) in neuronen onder de controle van de menselijke neuron-specifieke Thy1 promotor⁷uitdrukt. Deze muis maakt de analyse van neurofilament transport in situ met behulp van fluorescentie microscopie. In dit artikel beschrijven we de experimentele benaderingen voor het analyseren van neurofilamenttransport in geïhileerde axonen van scheenzuwen van deze muizen met behulp van twee benaderingen. De eerste van deze benaderingen is de hierboven beschreven puls-escape methode. Deze methode kan informatie genereren over het pauzeren van gedrag van de neurofilamenten, maar is blind voor de richting waarin de filamenten het geactiveerde gebied verlaten, en laat daarom geen meting van de netto directionaliteit en transportsnelheid⁸toe. De tweede van deze benaderingen is een nieuwe puls-spread methode waarbij we analyseren niet alleen het verlies van fluorescentie uit de geactiveerde regio, maar ook de voorbijgaande toename van fluorescentie in twee flankerende ramen waardoor de fluorescerende filamenten bewegen als ze vertrekken de geactiveerde regio in zowel anterograde en retrograde richtingen. In beide benaderingen kunnen parameters van neurofilamenttransport zoals de gemiddelde snelheid, netto directionaliteit en pauzegedrag worden verkregen door wiskundige analyse en modellering van de veranderingen in fluorescentie in de meetvensters. Figuur 3 illustreert deze twee benaderingen.

Dit protocol toont dissectie en voorbereiding van de zenuw, activering en beeldvorming van de paGFP fluorescentie, en kwantificering van neurofilament vervoer van de verworven beelden met behulp van de FIJI distributiepakket van ImageJ⁹. We gebruiken de scheenzenuw omdat het lang is (enkele cm) en niet vertakt; in principe is elke zenuw die paGFP-NFM uitdrukt echter geschikt voor gebruik met deze techniek als deze kan worden ontleed en ontleed zonder de axonen te beschadigen.