Imagem e Análise do Transporte de Neurofilamento em Nervo Tibial de Camundongo Excised

O transporte axonal de neurofilamentos foi demonstrado pela primeira vez na década de 1970 pela rotulagem de pulso radioisotópica¹. Essa abordagem tem gerado uma riqueza de informações sobre o transporte de neurofilamento in vivo,mas tem resolução espacial e temporal relativamente baixa, tipicamente na ordem dos milímetros e dias, no máximo². Além disso, a rotulagem de pulso radioisotópica é uma abordagem indireta que requer a injeção e o sacrifício de vários animais para gerar um curso único. Com a descoberta de proteínas fluorescentes e os avanços na microscopia de fluorescência na década de 1990, tornou-se posteriormente possível a imagem do transporte de neurofilamento diretamente em neurônios cultos em uma escala de tempo de segundos ou minutos e com resolução espacial sub-micrômetro, proporcionando uma visão muito maior do mecanismo do movimento³. Esses estudos revelaram que os polímeros de neurofilamento em axônios se movem de forma rápida e intermitente em direções anterogradas e retrógradas ao longo de trilhas de microtúbulos, impulsionados por proteínas motoras microtúbulas. No entanto, neurofilamentos são estruturas limitadas à difração com apenas 10 nm de diâmetro que são tipicamente espaçadas além de seus vizinhos por apenas dezenas de nanômetros; portanto, os polímeros só podem ser rastreados em neurônios cultivados que contenham neurofilamentos pouco distribuídos para que os polímeros em movimento possam ser resolvidos a partir de seus vizinhos⁴. Assim, não é possível rastrear neurofilamentos únicos em axônios que contenham polímeros neurofilados abundantes, como axônios mieliados.

Para analisar o transporte axonal de neurofilamentos em axônios ricos em neurofilamentos usando microscopia de fluorescência, utilizamos um método de fotoativação de fluorescência de fuga de pulso que desenvolvemos para estudar o comportamento de pausa a longo prazo de neurofilamentos em células nervosas cultivadas^4,,5. Neurofilamentos marcados com uma proteína de fusão de neurofilamento fluorescente fotoativat são ativados em um pequeno segmento de axônio, e então a taxa de saída desses filamentos da região ativada é quantificada pela medição da decadência da fluorescência ao longo do tempo. A vantagem dessa abordagem é que é uma análise em nível populacional do transporte de neurofilamento que pode ser aplicada em uma escala de tempo de minutos ou horas sem a necessidade de rastrear o movimento de polímeros de neurofilamento individual. Por exemplo, usamos este método para analisar a cinética do transporte de neurofilamento nas culturas mielique⁶.

Recentemente, descrevemos o desenvolvimento de um rato transgênico hThy1-paGFP-NFM que expressa baixos níveis de uma proteína de neurofilamento com marca paGFP M (paGFP-NFM) em neurônios sob o controle do promotor Thy1 específico do neurônio humano⁷. Este camundongo permite a análise do transporte de neurofilamento in situ usando microscopia de fluorescência. Neste artigo, descrevemos as abordagens experimentais para a análise do transporte de neurofilamento em axônios mieliados de nervos tibiais desses camundongos usando duas abordagens. A primeira dessas abordagens é o método de fuga de pulso descrito acima. Este método pode gerar informações sobre o comportamento de pausa dos neurofilamentos, mas é cego para a direção em que os filamentos partem da região ativada e, portanto, não permite a medição da direcionalidade líquida e da velocidade de transporte⁸. A segunda dessas abordagens é um novo método de propagação de pulso no qual analisamos não apenas a perda de fluorescência da região ativada, mas também o aumento transitório da fluorescência em duas janelas de flanqueamento através das quais os filamentos fluorescentes se movem à medida que saem da região ativada em direções anterogradas e retrógradas. Em ambas as abordagens, parâmetros de transporte de neurofilamento, como a velocidade média, direcionalidade líquida e comportamento de pausa podem ser obtidos utilizando-se análise matemática e modelagem das mudanças na fluorescência nas janelas de medição. A Figura 3 ilustra essas duas abordagens.

Este protocolo demonstra dissecação e preparação do nervo, ativação e imagem da fluorescência paGFP e quantificação do transporte de neurofilamento a partir das imagens adquiridas utilizando o pacote de distribuição FIJI da ImageJ⁹. Usamos o nervo tibial porque é longo (vários cm) e não ramifica; no entanto, em princípio, qualquer nervo que expresse paGFP-NFM é apropriado para uso com esta técnica se ela pode ser dissecada e desapeto sem danificar os axônios.