Excised Mouse Tibial Nerve Nörofilament Transport Görüntüleme ve Analizi
Summary
Fotoaktive nörofilament proteinini ifade eden transgenik farelerden periferik sinirlerin tek miyelinli aksonları içinde nörofilamentlerin aksonal naklini analiz etmek için floresan fotoaktivasyon yöntemlerini tanımlıyoruz.
Abstract
Nörofilament protein polimerleri aksonal taşımanın yavaş bileşeninde aksonlar boyunca ~0.35-3.5 mm/gün ortalama hızlarda hareket eder. Yakın zamana kadar yerinde bu hareketin çalışma sadece radyoizotopik darbe etiketleme kullanarak mümkün oldu, hangi gün bir zamansal çözünürlük ve milimetre bir mekansal çözünürlük ile tüm sinirlerde aksonal taşıma analizi sağlar. Yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlük ile yerinde nörofilament taşıma çalışma için, nörofilament protein M nöroniklerde fotoaktivabl GFP ile etiketlenmiş ifade eden bir hThy1-paGFP-NFM transgenik fare geliştirdi. Burada floresan fotoaktivasyon darbe kaçış ve nabız-spread yöntemleri bu fareler ex vivotibial sinirlerin tek miyelinli akson nörofilament taşıma analiz etmek için açıklar. İzole sinir segmentleri oksijenli salin ile perfüzyon ile mikroskop aşamasında korunur ve dönen disk konfokal floresan mikroskop mikroskopile görüntülenir. Mor ışık kısa bir aksonal pencerede floresan etkinleştirmek için kullanılır. Aktive ve yan bölgelerdefloresan zaman içinde analiz edilir, dakika ve mikron sırasına göre zamansal ve mekansal çözünürlük ile nörofilament taşıma çalışma izin, sırasıyla. Matematiksel modelleme hız, yön önyargı ve ortaya çıkan verilerden duraklama davranışı da dahil olmak üzere nörofilament taşıma kinetik parametreleri ayıklamak için kullanılabilir. Nabız kaçış ve nabız yayma yöntemleri de diğer sinirlerde nörofilament taşıma görselleştirmek için adapte edilebilir. Ek transgenik farelerin geliştirilmesi ile, bu yöntemler de görüntü ve akson diğer sitoskelet ve sitosolik proteinlerin aksonal taşıma analiz etmek için kullanılabilir.
Introduction
Nörofilamentlerin aksonal nakli ilk kez 1970’lerde radyoizotopik nabız etiketleme1ile gösterilmiştir. Bu yaklaşım in vivonörofilament taşıma hakkında bilgi zenginliği vermiştir , ama nispeten düşük uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahiptir, genellikle milimetre ve gün sırasına göre en iyi2. Ayrıca, radyoizotopik darbe etiketleme enjeksiyon ve tek bir zaman ders oluşturmak için birden fazla hayvan kurban gerektiren dolaylı bir yaklaşımdır. 1990’larda floresan proteinlerin keşfi ve floresan mikroskopi deki gelişmelerle, daha sonra nörofilament naklini doğrudan kültürlü nöronlarda saniye veya dakika lık bir zaman ölçeğinde ve mikrometre altı uzamsal çözünürlükte görüntülemek mümkün hale geldi ve hareketmekanizmasınaçok daha fazla fikir kazandırdı 3 . Bu çalışmalar, aksonların nörofilament polimerlerinin mikrotübül motor proteinleri tarafından itilen mikrotübül parçaları boyunca hem anterograd hem de retrograd yönlerde hızlı ve aralıklı olarak hareket ettiğini ortaya koymuştur. Ancak, nörofilamentler genellikle nanometre sadece onlarca tarafından komşularından ayrı aralıklı olan çapı sadece 10 nm kırınım sınırlı yapılardır; bu nedenle, polimerler sadece hareket eden polimerler komşularından çözülebilir böylece seyrek dağıtılmış nörofilamentler içeren kültürlü nöronlar izlenebilir4. Bu nedenle, miyelinatlı aksongibi bol nörofilament polimerler içeren aksonlarda tek nörofilamentleri takip etmek günümüzde mümkün değildir.
Floresan mikroskopisi kullanarak nörofilament açısından zengin aksonların nörofilamentlerin aksonal naklini analiz etmek için, kültürlü sinir hücrelerindeki nörofilamentlerin uzun süreli duraklama davranışını incelemek için geliştirdiğimiz floresan fotoaktivasyon darbe kaçış yöntemini kullanıyoruz4,5. Fotoaktibl floresan nörofilament füzyon proteini ile etiketlenen nörofilamentler akson kısa bir segmentte aktive edilir, ve daha sonra aktive bölgeden bu filamentlerin ayrılma oranı zaman içinde floresan çürüme ölçülerek ölçülür. Bu yaklaşımın avantajı, tek tek nörofilament polimerlerin hareketini izlemek için gerek kalmadan dakika veya saat bir zaman ölçeğinde uygulanabilir nörofilament taşıma bir nüfus düzeyinde analizi olmasıdır. Örneğin, miyelinating kültürlerde nörofilament transport kinetik analiz etmek için bu yöntemi kullandık6.
Son zamanlarda, insan nöron spesifik Thy1 organizatörü kontrolü altında nöronlarda bir paGFP etiketli nörofilament protein M (paGFP-NFM) düşük seviyelerde ifade bir hThy1-paGFP-NFM transgenik fare gelişimini anlattı7. Bu fare floresan mikroskopisi kullanarak yerinde nörofilament taşıma analizine izin verir. Bu makalede, bu farelerden gelen tibial sinirlerin miyelinli aksonları nörofilament naklini analiz etmek için deneysel yaklaşımları iki yaklaşım la açıklıyoruz. Bu yaklaşımlardan ilki yukarıda açıklanan darbe kaçış yöntemidir. Bu yöntem nörofilamentlerin duraklama davranışı hakkında bilgi üretebilir, ancak filamentlerin aktive edilen bölgeden ayrıldığı yöne kördür ve bu nedenle net yön ve taşıma hızının ölçülmesine izin vermez8. Bu yaklaşımların ikincisi, sadece aktive bölgeden gelen floresan kaybını değil, aynı zamanda floresan filamentlerin aktive edilen bölgeden hem anterograd hem de retrograd yönlerde hareket ettikleri iki yan penceredeki floresan geçici artışı da analiz ettiğimiz yeni bir nabız yayma yöntemidir. Her iki yaklaşımda da ortalama hız, net yönlülük ve duraklama davranışı gibi nörofilament taşıma parametreleri matematiksel analiz ve ölçüm pencerelerinde floresan değişikliklerin modelalınması ile elde edilebilir. Şekil 3 bu iki yaklaşımı göstermektedir.
Bu protokol, imageJ9’unFIJI dağıtım paketini kullanarak elde edilen görüntülerden sinirin diseksiyonunu ve hazırlanmasını, paGFP floresansının aktivasyonu ve görüntülenmesi ve nörofilament taşınmasının niceliğini göstermektedir. Kaval siniri uzun (birkaç cm) olduğu ve dallanmadığı için kullanıyoruz; ancak, ilke olarak paGFP-NFM ifade eden herhangi bir sinir aksonlar zarar vermeden diseksiyon ve de-sheathed olabilir eğer bu teknik ile kullanmak için uygundur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakım-kaçış ve nabız yayılımı deneylerinin analizinde dikkatli olunmalıdır, çünkü özellikle düz alan düzeltmesi, görüntü hizalama ve çamaşır suyu düzeltmesi sırasında, işlem sonrası hatanın ortaya çıkması için önemli bir potansiyel vardır. Düz alan düzeltmesi, aydınlanmadaki tekdüzelik için düzeltmegereklidir, bu da merkezden çevreye görüş alanı boyunca yoğunlukta bir düşüşe neden olur. Tekdüzeliğin kapsamı dalga boyuna bağlıdır ve bu nedenle, her zaman deneysel ver…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar öğretim ve konfokal mikroskopi ve tibial sinir diseksiyonu ve Dr Atsuko Uchida, Chloe Duger ve Sana Chahande fare yetiştiriciliği ile yardım için yardım için Paula Monsma teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma kısmen A.B.’ye ios1656784 osb’nin ortak Ulusal Bilim Vakfı Hibeleri tarafından desteklenmiştir. ve IOS1656765 P.J., ve Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 NS038526, P30 NS104177 ve S10 OD010383 A.B. N.P.B. Ohio State Üniversitesi Rektörü’nün Doktora Sonrası Akademisyenler Programı’ndan bir burs tarafından desteklendi.
Materials
| 14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm | Bioptechs | 1907-1422-100 | inner gasket |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma | D6134 | |
| 30mm Round Gasket w/ Holes | Bioptechs | 1907-08-750 | outer gasket |
| 35 x 10mm dish | Thermo Fisher | 153066 | dissection dishes |
| 40mm round coverslips | Bioptechs | 40-1313-0319 | |
| 60mL syringe – Luer-lock tip | BD | 309653 | |
| Andor Revolution WD spinning-disk confocal system | Andor | outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems | |
| Calcium chloride | Fisher | C79 | |
| Coverslips | Fisher | 12-541-B | for fluorescein slide |
| D-(+)-glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26001-70 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | fine tipped forceps |
| Dissection microscope | Zeiss | 47 50 03 | |
| Dissection pan with wax | Ginsberg Scientific | 568859 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | initial dissection scissors |
| FCS2 perfusion chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
| Fluorescein sodium | Fluka | 46960 | |
| Inline solution heater | Warner Instruments | SH27-B | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | initial dissection forceps |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microaqueduct slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | for fluorescein slide |
| Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | I-3017 | |
| Objective heater system | Okolab | Oko Touch with objective collar | |
| Objective oil – type A | Nikon | discontinued | |
| Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective | Nikon | MRD01901 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium iodoacetate | Sigma-Aldrich | I2512 | |
| Syringe pump | Sage Instruments | Model 355 | |
| Tubing adapter – female | Small Parts Inc. | 1005109 | |
| Tubing adapter – male | Small Parts Inc. | 1005012 | |
| Tygon tubing | Bioptechs | 1/16" ID, 1/32" wall thickness | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | fine scissors |
References
- Hoffman, P. N., Lasek, R. J. The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons. Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).
- Brown, A. Slow Axonal Transport. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
- Wang, L., Ho, C. -. L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses. Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).
- Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons. Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).
- Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons. Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).
- Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells. Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).
- Walker, C. L., et al. Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier. Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).
- Li, Y., Brown, A., Jung, P. Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method. Physical Biology. 11 (2), 026001 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Breuer, A. C., et al. Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis. Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).
- Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Model, M. Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes. Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).
- Schmidt, M. M., Dringen, R. Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes. Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).
- Surre, J., et al. Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival. Scientific Reports. 8 (1), 12088 (2018).
- Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images. Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).
- Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein. Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).
- Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics. Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).
- Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses. Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).
- Xu, Z., Tung, V. W. Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons. Neuroscience. 102 (1), 193-200 (2001).
- Jung, P., Brown, A. Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve. Physical Biology. 6 (4), 046002 (2009).
- Cohen, J. The effect size index: d. Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed. , 20-26 (1988).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
- Gilley, J., et al. Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a “P301L” tau knockin mouse. Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).
- Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).
- Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability. Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
