Bewertung der zellulären Oxidation mit einem subzellulären Kompartiment-spezifischeredox-sensitivegrüne fluoreszierende Protein
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Bewertung des subzellulären Kompartiment-spezifischen Redoxstatus innerhalb der Zelle. Eine redoxempfindliche Fluoreszenzsonde ermöglicht eine komfortable ratiometrische Analyse in intakten Zellen.
Abstract
Die Messung des intrazellulären Oxidations-/Reduktionsgleichgewichts bietet einen Überblick über den physiologischen und/oder pathophysiologischen Redoxstatus eines Organismus. Thiole sind besonders wichtig für die Beleuchtung des Redoxstatus von Zellen über ihre reduzierten Dithiol- und oxidierten Disulfidverhältnisse. Entwickelte cysteinhaltige fluoreszierende Proteine eröffnen eine neue Ära für Redox-empfindliche Biosensoren. Eines davon, redoxsensitives grünes fluoreszierendes Protein (roGFP), kann leicht in Zellen mit adenoviraler Transduktion eingeführt werden, so dass der Redoxstatus subzellulärer Kompartimente ausgewertet werden kann, ohne zelluläre Prozesse zu stören. Reduzierte Cysteins und oxidierte Zystiker von roGFP haben Anregungsmaxima bei 488 nm bzw. 405 nm, mit Emission bei 525 nm. Die Beurteilung der Verhältnisse dieser reduzierten und oxidierten Formen ermöglicht die bequeme Berechnung des Redox-Gleichgewichts innerhalb der Zelle. In diesem Methodenartikel wurden verewigte menschliche dreifach-negative Brustkrebszellen (MDA-MB-231) verwendet, um den Redoxstatus innerhalb der lebenden Zelle zu bewerten. Die Protokollschritte umfassen MDA-MB-231 Zelllinientransduktion mit Adenovirus zur Exprimierbarkeit von Zytosol-RoGFP, Behandlung mit H2O2und Bewertung des Cystein- und Cystin-Verhältnisses mit Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie.
Introduction
Oxidativer Stress wurde 1985 von Helmut Sies als “Störung des prooxidant-antioxidativen Gleichgewichts zu Gunsten des ersten”definiert,und es wurde eine Fülle von Forschungsarbeiten durchgeführt, um einen krankheits-, ernährungs- und alterungsspezifischen Redoxstatus von Organismen1,2,3zu erhalten. Seitdem ist das Verständnis von oxidativem Stress breiter geworden. Das Testen der Hypothesen der Verwendung von Antioxidantien gegen Krankheiten und/oder Alterung hat gezeigt, dass oxidativer Stress nicht nur Schaden verursacht, sondern auch andere Rollen in Zellen spielt. Darüber hinaus haben Wissenschaftler gezeigt, dass freie Radikale eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion2spielen. Alle diese Studien stärken die Bedeutung der Bestimmung der Veränderungen des Reduktions-Oxidations-Verhältnisses (Redox) von Makromolekülen. Enzymaktivität, Antioxidantien und/oder Oxidationsmittel sowie Oxidationsprodukte können mit verschiedenen Methoden bewertet werden. Unter diesen, Methoden, die Thiol-Oxidation bestimmen sind wohl die am häufigsten verwendeten, weil sie über das Gleichgewicht zwischen Antioxidantien und Prooxidantien in Zellen berichten, sowie Organismen4. Insbesondere werden die Verhältnisse zwischen Glutathion (GSH)/Glutathiondisulfid (GSSG) und/oder Cystein (CyS)/Cystin (CySS) als Biomarker zur Überwachung des Redoxstatus von Organismen2verwendet.
Methoden, die zur Aschägung des Gleichgewichts zwischen Prooxidanzien und Antioxidantien verwendet werden, basieren hauptsächlich auf dem Niveau reduzierter/oxidierter Proteine oder kleiner Moleküle in Zellen. Westliche Flecken und Massenspektrometrie werden verwendet, um die Verhältnisse von reduzierten/oxidierten Makromolekülen (Protein, Lipide usw.) umfassend zu bewerten, und GSH/GSSG-Verhältnisse können mit Spektrophotometrie5bewertet werden. Ein gemeinsames Merkmal dieser Methoden ist die physikalische Störung des Systems durch Zelllyse und/oder Gewebehomogenisierung. Diese Analysen werden auch dann schwierig, wenn es notwendig ist, den Oxidationsstatus verschiedener Zellkompartimente zu messen. Alle diese Störungen verursachen Artefakte in der Assay-Umgebung.
Redoxempfindliche fluoreszierende Proteine eröffneten eine vorteilhafte Ära zur Bewertung des Redoxgleichgewichts, ohne eine Störung in den Zellen zu verursachen6. Sie können verschiedene intrazelluläre Kompartimente ins Visier nehmen, um die Quantifizierung von kompartifenspezifischen Aktivitäten (z. B. Die Untersuchung des Redoxzustands von Mitochondrien und des Zytosols) zu ermöglichen, um das Übersprechen zwischen zellulären Organellen zu untersuchen. Gelbefluoreszenzproteine (YFP), grünes fluoreszierendes Protein (GFP) und HyPeR-Proteine werden von Meyer undKollegen6 überprüft. Unter diesen Proteinen ist Redox-sensitive sywertGFP (roGFP) aufgrund unterschiedlicher fluoreszierender Auslesungen seiner CyS (z.B. 488 nm/em. 525 nm) und CySS (z.B. 405 nm/525 nm) Rückstände einzigartig, was im Gegensatz zu anderen Redox-empfindlichen Proteinen wie YFP7,8eine ratiometrische Analyse ermöglicht, was eine ratiometrische Analyse ermöglicht. Die ratiometrische Ausgabe ist wertvoll, da sie die Unterschiede zwischen Expressionsstufen, Erkennungsempfindlichkeiten und Photobleaching8ausbalanciert. Subzelluläre Kompartimente von Zellen (Zytosol, Mitochondrien, Kern) oder verschiedenen Organismen (Bakterien sowie Säugetierzellen) können durch Modifizieren von roGFP7,9,10gezielt werden.
roGFP-Assays werden mit fluoreszierenden Bildgebungstechniken durchgeführt, insbesondere für Echtzeit-Visualisierungsexperimente. Flow-zytometrische Analysen von roGFPs sind auch für Experimente mit vorgegebenen Zeitpunkten möglich. Der aktuelle Artikel beschreibt sowohl die Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie als auch die Durchflusszytometrie, um eine ratiometrische Bewertung des Redoxstatus in Säugetierzellen durchzuführen, die roGFP (gezielt auf Zytosol) über adenovirale Transduktion überexzieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Thiol/Disulfid-Gleichgewicht in einem Organismus spiegelt den Redoxstatus von Zellen wider. Lebende Organismen haben Glutathion, Cystein, Proteinthiole und niedermolekulare Thiole, die alle von der Oxidation betroffen sind und den Redoxstatus der Zellen4wiedergeben. Technische ROGFPs ermöglichen die unterbrechungsfreie Quantifizierung des Thiol/Disulfid-Gleichgewichts über ihre CyS-Rückstände7. Die ratiometrische Eigenschaft von roGFP liefert zuverlässige Redoxmess…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Das Konstrukt und rekombinante Adenovirus zur Exdinierung von Cytosol-spezifischem RoGFP in Zellen wurden im Labor von Paul T. Schumacker, PhD, Freiberg School of Medicine, Northwestern University und ViraQuest Inc. erzeugt. Diese Studie wurde vom Center for Studies of Host Response to Cancer Therapy Grant P20GM109005 durch das NIH National Institute of General Medical Sciences Centers of Biomedical Research Excellence (COBRE NIGMS), National Institute of General Medical Sciences Systems Pharmacology and Toxicology Training Program Grant T32 GM106999, UAMS Foundation/Medical Research Endowment Award AWD00053956, UAMS Year-End Chancellor es Awards AWD00053484. Die Durchflusszytometrie-Kernanlage wurde teilweise vom Center for Microbial Pathogenesis und Host Inflammatory Responses Grant P20GM103625 über das COBRE NIGMS unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten des NIH dar. ATA wurde vom Wissenschafts- und Technologieforschungsrat der Türkei (TUBITAK) 2214-A Stipendium unterstützt.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Sciences | 25200-056 | Cell culture |
| 4-well chamber slide | Thermo Scientific | 154526 | Cell seeding material for fluorescent imaging |
| 5 ml tubes with cell strainer cap | Falcon | 352235 | Single cell suspension tube for flow cytometry analysis |
| 6-well plate | Corning | 353046 | Cell seeding material for flow cytometry analysis |
| 15 ml conical tubes | MidSci | C15B | Cell culture |
| 75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks | Corning | 4306414 | Cell culture |
| Adenoviral cytosol specific roGFP | ViraQuest | VQAd roGFP | roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker |
| Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | Cell culture |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting |
| Countess cell counter chamber slides | Invitrogen | C10283 | Cell counting |
| DMEM | Gibco by Life Sciences | 11995-065 | Cell culture |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 20 µl | Fisherbrand | 02-717-161 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 1000 µl | Fisherbrand | 02-717-166 | Cell culture |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses |
| Fluorescent Microscope | Advanced Microscopy Group (AMG) | Evos FL | Fluorescent imaging |
| Hydrogen Peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 | Positive control |
| Light Cube, Custom | Life Sciences | CUB0037 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm) |
| Light Cube, GFP | Thermo Scientific | AMEP4651 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm) |
| MDA-MB-231 | American Tissue Culture Collection | HTB-26 | Human epithelial breast cancer cell line |
| Microcentrifuge tubes, 2 ml | Grenier Bio-One | 623201 | Cell culture |
| PBS | Gibco by Life Sciences | 10010-023 | Cell culture |
| Pipet controller | Drummond | Hood Mate Model 360 | Cell culture |
| Serologycal pipet, 1 ml | Fisherbrand | 13-678-11B | Cell culture |
| Serologycal pipet, 5 ml | Fisherbrand | 13-678-11D | Cell culture |
| Serologycal pipet, 10 ml | Fisherbrand | 13-678-11E | Cell culture |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | HERACell 150i | CO2 incubator for cell culture |
| Trypan blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell counting |
References
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