Hücre altı kompartmana özgü Redoksduyarlı Yeşil Floresan Protein kullanılarak Hücresel Oksidasyonun Değerlendirilmesi
Summary
Bu protokol hücre içinde hücre altı bölmesi özgü redoks durumunun değerlendirilmesi açıklanır. Redoksduyarlı floresan prob bozulmamış hücrelerde uygun oranmetrik analiz sağlar.
Abstract
Hücre içi oksidasyon/redüksiyon dengesinin ölçülmesi, bir organizmanın fizyolojik ve/veya patofizyolojik redoks durumuna genel bir bakış sağlar. Tiyoller, azaltılmış dithiol ve okside disülfür oranları ile hücrelerin redoks durumunu aydınlatmak için özellikle önemlidir. Tasarlanmış sistein içeren floresan proteinler redoksduyarlı biyosensörler için yeni bir dönem açar. Bunlardan biri olan redoksduyarlı yeşil floresan protein (roGFP), adenoviral transdüksiyonlu hücrelere kolayca girilebilir ve hücre altı bölmelerin redoks durumunun hücresel süreçleri bozmadan değerlendirilmesine olanak sağlar. RoGFP azaltılmış sistein ve oksitlenmiş sistinler sırasıyla 488 nm ve 405 nm, emisyon ile 525 nm uyarma maxima var. Bu indirgenmiş ve oksitlenmiş formların oranlarının değerlendirilmesi hücre içinde redoks dengesinin uygun hesaplanmasına olanak sağlar. Bu yöntemde canlı hücre içindeki redoks durumunu değerlendirmek için ölümsüzleştirilmiş insan üçlü negatif meme kanseri hücreleri (MDA-MB-231) kullanılmıştır. Protokol adımları sitosolik roGFP ifade etmek için adenovirüs ile MDA-MB-231 hücre hattı transdüksiyon, H2O2ile tedavi ve hem akış sitometri ve floresan mikroskopi ile sistein ve sistin oranının değerlendirilmesi içerir.
Introduction
Oksidatif stres 1985 yılında Helmut Sies tarafından “eski lehine prooksidant-antioksidan dengesi nde bir bozukluk” olarak tanımlanmıştır1, ve araştırma bir bolluk organizmaların hastalık elde etmek için yapılmıştır-, beslenme-, ve organizmaların yaşlanmaya özgü redoks durumu1,2,3. O zamandan beri, oksidatif stres anlayışı geniş hale gelmiştir. Hastalıklara ve/veya yaşlanmaya karşı antioksidan kullanma hipotezlerinin test edilmesi oksidatif stresin sadece zarar vermekle kalmamış, aynı zamanda hücrelerde başka rolleri de olduğunu göstermiştir. Ayrıca, bilim adamları serbest radikallerin sinyal iletimi için önemli bir rol oynadığını göstermiştir2. Tüm bu çalışmalar makromoleküllerin redüksiyon-oksidasyon (redoks) oranındaki değişikliklerin belirlenmesinin önemini güçlendirmiştir. Enzim aktivitesi, antioksidanlar ve/veya oksidanlar ve oksidasyon ürünleri çeşitli yöntemlerle değerlendirilebilir. Bunlar arasında, thiol oksidasyonunu belirleyen yöntemler tartışmasız en çok kullanılan lar dır çünkü hücrelerdeki antioksidanlar ve prooksidantlar arasındaki dengeyi veorganizmaları4 . Özellikle glutatyon (GSH)/glutatyon disülfür (GSSG) ve/veya sistein (CyS)/sistin (CySS) arasındaki oranlar organizmaların redoks durumunu izlemek için biyobelirteç olarak kullanılmaktadır2.
Prooksidantlar ve antioksidanlar arasındaki dengeyi dengelemek için kullanılan yöntemler esas olarak hücrelerdeki azaltılmış/oksitlenmiş proteinlerin veya küçük moleküllerin seviyelerine dayanır. Batı lekeleri ve kütle spektrometresi, azaltılmış/okside makromoleküllerin (protein, lipidler vb.) oranlarını genel olarak değerlendirmek için kullanılır ve GSH/GSSG oranları spektrofotometri ile değerlendirilebilir5. Bu yöntemlerin ortak bir özelliği, hücre lisisi ve/veya doku homojenizasyonu ile sistemin fiziksel tedirginliğidir. Bu analizler, farklı hücresel bölmelerin oksidasyon durumunu ölçmek gerektiğinde de zorlaşır. Tüm bu tedirginlikler, adak ortamında eserlere neden olur.
Redoks duyarlı floresan proteinler hücrelerde bir rahatsızlık neden olmadan redoks dengesini değerlendirmek için avantajlı bir dönem açtı6. Hücre içi bölmeleri hedefleyerek, hücre içi aktivitelerin ölçülmesine izin verebilirler (örneğin, mitokondri ve sitosolun redoks durumunu atayarak) hücresel organeller arasındaki çapraz konuşmayı araştırmak için. Sarı floresan protein (YFP), yeşil floresan protein (GFP) ve HyPeR proteinleri Meyer ve meslektaşları tarafından gözden geçirilir6. Bu proteinler arasında, redoks duyarlı GFP (roGFP) onun CyS farklı floresan okumalar nedeniyle benzersizdir (ör. 488 nm / em. 525 nm) ve CySS (ör. 405 nm/525 nm) kalıntılar, hangi oranmetrik analiz izin, Y7FPgibi diğer redoks duyarlı proteinlerin aksine,8. Oranmetrik çıktı, ifade düzeyleri, algılama hassasiyetleri ve fotobeyaztma8arasındaki farkları dengelediği için değerlidir. Hücrelerin hücre altı bölmeleri (sitosol, mitokondri, çekirdek) veya farklı organizmalar (bakteri yanı sıra memeli hücreleri) roGFPdeğiştirerekhedef olabilir 7,9,10.
roGFP tahlilleri, özellikle gerçek zamanlı görselleştirme deneyleri için floresan görüntüleme teknikleri kullanılarak gerçekleştirilmektedir. RoGFO’ların akış sitometrik analizleri, önceden belirlenmiş zaman noktalarına sahip deneyler için de mümkündür. Bu makalede, adenoviral transdüksiyon yoluyla roGFP (sitosol hedefli) aşırı ifade memeli hücrelerinde redoks durumunun ratiometrik bir değerlendirme yapmak için floresan mikroskopi ve akış sitometri sitometri kullanımı hem de açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir organizmadaki tiyol/disülfür dengesi hücrelerin redoks durumunu yansıtır. Yaşayan organizmalar glutatyon var, sistein, protein tiyolleri, ve düşük molekül ağırlıklı tiyoller, hepsi oksidasyon düzeyi etkilenir ve hücrelerin redoks durumunu yankı4. Mühendislik roGFPs kendi CySartıkları7 ile tiol / disülfür dengesinin non-yıkıcı nicel izin verir. roGFP’nin oranmetrik özelliği memeli hücreleri için güvenilir redoks ölçümleri sağlar. roGFP t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hücrelerde sitosol spesifik roGFP ifade etmek için yapı ve rekombinant adenovirüs Paul T. Schumacker, Doktora, Freiberg Tıp Fakültesi, Northwestern Üniversitesi ve ViraQuest Inc, sırasıyla laboratuvarda oluşturuldu. Bu çalışma, NIH Ulusal Biyomedikal Araştırma Mükemmeliyet Merkezleri Enstitüsü (COBRE NIGMS), Ulusal Genel Tıp Bilimleri Sistemleri Farmakoloji ve Toksikoloji Eğitim Programı Hibe T32 GM106999, UAMS Vakfı / Tıbbi Araştırma Bağış Ödülü AWD00053956, UAMS Yıl Sonu Şansölye Ödülleri AWD00053484. Akış sitometri çekirdek tesisi kısmen Mikrobiyal Patogenez Merkezi tarafından desteklendi ve Cobre NIGMS aracılığıyla P20GM103625’e Ev Sahipliği Yaptı Inflamatuar Yanıtlar hibe sitometrisi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve NIH’nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. ATA, Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurulu (TÜBİTAK) 2214-A bursu ile desteklendi.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Sciences | 25200-056 | Cell culture |
| 4-well chamber slide | Thermo Scientific | 154526 | Cell seeding material for fluorescent imaging |
| 5 ml tubes with cell strainer cap | Falcon | 352235 | Single cell suspension tube for flow cytometry analysis |
| 6-well plate | Corning | 353046 | Cell seeding material for flow cytometry analysis |
| 15 ml conical tubes | MidSci | C15B | Cell culture |
| 75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks | Corning | 4306414 | Cell culture |
| Adenoviral cytosol specific roGFP | ViraQuest | VQAd roGFP | roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker |
| Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | Cell culture |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting |
| Countess cell counter chamber slides | Invitrogen | C10283 | Cell counting |
| DMEM | Gibco by Life Sciences | 11995-065 | Cell culture |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 20 µl | Fisherbrand | 02-717-161 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 1000 µl | Fisherbrand | 02-717-166 | Cell culture |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses |
| Fluorescent Microscope | Advanced Microscopy Group (AMG) | Evos FL | Fluorescent imaging |
| Hydrogen Peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 | Positive control |
| Light Cube, Custom | Life Sciences | CUB0037 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm) |
| Light Cube, GFP | Thermo Scientific | AMEP4651 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm) |
| MDA-MB-231 | American Tissue Culture Collection | HTB-26 | Human epithelial breast cancer cell line |
| Microcentrifuge tubes, 2 ml | Grenier Bio-One | 623201 | Cell culture |
| PBS | Gibco by Life Sciences | 10010-023 | Cell culture |
| Pipet controller | Drummond | Hood Mate Model 360 | Cell culture |
| Serologycal pipet, 1 ml | Fisherbrand | 13-678-11B | Cell culture |
| Serologycal pipet, 5 ml | Fisherbrand | 13-678-11D | Cell culture |
| Serologycal pipet, 10 ml | Fisherbrand | 13-678-11E | Cell culture |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | HERACell 150i | CO2 incubator for cell culture |
| Trypan blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell counting |
References
- Sies, H. Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Jones, D. P. Redefining Oxidative Stress. Antioxidants & Redox Signalling. 8 (9-10), (2006).
- Pizzino, G., et al. Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 20117, 8416763 (2017).
- Go, Y. M., Jones, D. P. Thiol/disulfide redox states in signaling and sensing. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 48 (2), 173-191 (2013).
- Hansen, J. M., Go, Y., Jones, D. P. Nuclear and Mitochondrial Compartmentation of Oxidative Stress and Redox Signaling. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 46 (1), 215-234 (2006).
- Meyer, A. J., Dick, T. P. Fluorescent protein-based redox probes. Antioxidants and Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Björnberg, O., Østergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxidants and Redox Signaling. 8 (3-4), 354-361 (2006).
- Bhaskar, A., et al. Reengineering Redox Sensitive GFP to Measure Mycothiol Redox Potential of Mycobacterium tuberculosis during Infection. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003902 (2014).
- Loor, G., et al. Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1813 (7), 1382-1394 (2011).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Loor, G., et al. Menadione triggers cell death through ROS-dependent mechanisms involving PARP activation without requiring apoptosis. Free Radical Biology and Medicine. 49 (12), 1925-1936 (2010).
- Esposito, S., et al. Redox-sensitive GFP to monitor oxidative stress in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 28 (2), 133-144 (2017).
- Meyer, A. J., et al. Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer. Plant Journal. 52 (5), 973-986 (2007).
- Galvan, D. L., et al. Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy. Kidney International. 92 (5), 1282-1287 (2017).
- Swain, L., Nanadikar, M. S., Borowik, S., Zieseniss, A., Katschinski, D. M. Transgenic organisms meet redox bioimaging: One step closer to physiology. Antioxidants and Redox Signaling. 29 (6), 603-612 (2018).
- Gutscher, M., et al. Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology and Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
- Dey, S., Sidor, A., O’Rourke, B. Compartment-specific control of reactive oxygen species scavenging by antioxidant pathway enzymes. Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11185-11197 (2016).
