Evaluación de la oxidación celular utilizando una proteína fluorescente verde sensible al redox específica del compartimento subcelular
Summary
Este protocolo describe la evaluación del estado redox subcelular específico del compartimento dentro de la célula. Una sonda fluorescente sensible al redox permite un análisis ratiométrico conveniente en las células intactas.
Abstract
La medición del equilibrio de oxidación/reducción intracelular proporciona una visión general del estado redox fisiológico y/o fisiopatológico de un organismo. Los tioles son especialmente importantes para iluminar el estado redox de las células a través de sus proporciones reducidas de ditiool y disulfuro oxidado. Las proteínas fluorescentes que contienen cisteína de diseño abren una nueva era para los biosensores sensibles al redox. Una de ellas, la proteína fluorescente verde sensible al redox (roGFP), se puede introducir fácilmente en las células con transducción adenoviral, lo que permite evaluar el estado redox de los compartimentos subcelulares sin interrumpir los procesos celulares. Las ciisteínas reducidas y las cistinas oxidadas de roGFP tienen máximas de excitación a 488 nm y 405 nm, respectivamente, con emisión a 525 nm. La evaluación de las proporciones de estas formas reducidas y oxidadas permite el cálculo conveniente del equilibrio redox dentro de la célula. En este artículo del método, se utilizaron células de cáncer de mama de triple negativo humano inmortalizados (MDA-MB-231) para evaluar el estado de redox dentro de la célula viva. Los pasos del protocolo incluyen la transducción de línea celular MDA-MB-231 con adenovirus para expresar roGFP citosólico, el tratamiento con H2O2y la evaluación de la relación de cisteína y cistina con citometría de flujo y microscopía de fluorescencia.
Introduction
El estrés oxidativo fue definido en 1985 por Helmut Sies como “una alteración en el equilibrio prooxidante-antioxidante a favor de la primera”1, y se ha llevado a cabo una plétora de investigación para obtener enfermedad-, nutrición-, y el envejecimiento-específico estado redox de los organismos1,2,3. Desde entonces, la comprensión del estrés oxidativo se ha vuelto más amplia. Probar las hipótesis del uso de antioxidantes contra enfermedades y/o envejecimiento ha demostrado que el estrés oxidativo no sólo causa daño, sino que también tiene otras funciones en las células. Además, los científicos han demostrado que los radicales libres desempeñan un papel importante en la transducción de señales2. Todos estos estudios refuerzan la importancia de determinar los cambios en la relación reducción-oxidación (redox) de las macromoléculas. La actividad enzimática, antioxidantes y/o oxidantes, y los productos de oxidación se pueden evaluar con varios métodos. Entre estos, los métodos que determinan la oxidación del tiol son posiblemente los más utilizados porque informan sobre el equilibrio entre antioxidantes y proxóxidos en las células, así como los organismos4. Específicamente, las relaciones entre el disulfuro de glutatión (GSH)/glutatión (GSSG) y/o cisteína (CyS)/cistina (CySS) se utilizan como biomarcadores para controlar el estado de redox de los organismos2.
Los métodos utilizados para el ensayo del equilibrio entre prooxidantes y antioxidantes dependen principalmente de los niveles de proteínas reducidas/oxidadas o moléculas pequeñas dentro de las células. Las manchas occidentales y la espectrometría de masas se utilizan para evaluar ampliamente las proporciones de macromoléculas reducidas/oxidadas (proteínas, lípidos, etc.), y las proporciones GSH/GSSG se pueden evaluar con espectrofotometría5. Una característica común de estos métodos es la perturbación física del sistema por lelisis celular y/o homogeneización tisular. Estos análisis también se vuelven desafiantes cuando es necesario medir el estado de oxidación de diferentes compartimentos celulares. Todas estas perturbaciones causan artefactos en el entorno de ensayo.
Las proteínas fluorescentes sensibles a redox abrieron una era ventajosa para evaluar el equilibrio redox sin causar una perturbación en las células6. Pueden apuntar a diferentes compartimentos intracelulares, permitiendo la cuantificación de actividades específicas del compartimiento (por ejemplo, el ensayo del estado redox de las mitocondrias y el citosol) para investigar la interferencia entre los orgánulos celulares. Meyer y sus colegas6revisan la proteína fluorescente amarilla (YFP), la proteína fluorescente verde (GFP) y las proteínas HyPeR. Entre estas proteínas, GFP sensible al redox (roGFP) es único debido a las diferentes lecturas fluorescentes de sus residuos CyS (por ejemplo, 488 nm/em. 525 nm) y CySS (por ejemplo, 405 nm/525 nm), que permite el análisis ratiométrico, a diferencia de otras proteínas sensibles al redox como YFP7,,8. La salida ratiométrica es valiosa porque contrarresta las diferencias entre los niveles de expresión, las sensibilidades de detección y el fotoblanqueo8. Los compartimentos subcelulares de las células (citosol, mitocondrias, núcleo) u diferentes organismos (bacterias, así como células de mamíferos) pueden ser objetivo mediante la modificación de roGFP7,9,10.
Los ensayos roGFP se llevan a cabo utilizando técnicas de imagen fluorescente, especialmente para experimentos de visualización en tiempo real. Los análisis citométricos de flujo de roGMP también son posibles para experimentos con puntos de tiempo predeterminados. El artículo actual describe tanto el uso de la microscopía fluorescente como la citometría de flujo para realizar una evaluación ratiométrica del estado de redox en las células de los mamíferos que sobreexpresan el roGFP (dirigido al citosol) a través de la transducción adenoviral.
Protocol
Representative Results
Discussion
El equilibrio tiol/disulfuro en un organismo refleja el estado redox de las células. Los organismos vivos tienen glutatión, cisteína, tioles proteicos y tioles de bajo peso molecular, todos los cuales se ven afectados por el nivel de oxidación y se hacen eco del estado redox de las células4. Los roGRP diseñados permiten la cuantificación no disruptiva del equilibrio tiol/disulfuro a través de sus residuos CyS7. La propiedad ratiométrica de roGFP proporciona medicio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El adenovirus constructor y recombinante para expresar roGFP específico de citosol en células se generó en el laboratorio de Paul T. Schumacker, PhD, Freiberg School of Medicine, Northwestern University y ViraQuest Inc., respectivamente. Este estudio fue apoyado por el Centro de Estudios de Respuesta Anfitriona a la Terapia del Cáncer subvención P20GM109005 a través del NIH National Institute of General Medical Sciences Centers of Biomedical Research Excellence (COBRE NIGMS), National Institute of General Medical Sciences Systems Pharmacology and Toxicology Training Program grant T32 GM106999, UAMS Foundation/Medical Research Endowment Award AWD00053956, UAMS Year-End Chancellor’s Awards AWD00053484. La instalación del núcleo de citometría de flujo fue apoyada en parte por el Centro de Patogénesis Microbiana y Respuestas Inflamatorias anfitrionas otorgadaS P20GM103625 a través del COBRE NIGMS. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH. ATA fue apoyada por la beca 2214-A del Consejo de Investigación Científica y Tecnológica de Turquía (TUBITAK).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Sciences | 25200-056 | Cell culture |
| 4-well chamber slide | Thermo Scientific | 154526 | Cell seeding material for fluorescent imaging |
| 5 ml tubes with cell strainer cap | Falcon | 352235 | Single cell suspension tube for flow cytometry analysis |
| 6-well plate | Corning | 353046 | Cell seeding material for flow cytometry analysis |
| 15 ml conical tubes | MidSci | C15B | Cell culture |
| 75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks | Corning | 4306414 | Cell culture |
| Adenoviral cytosol specific roGFP | ViraQuest | VQAd roGFP | roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker |
| Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | Cell culture |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting |
| Countess cell counter chamber slides | Invitrogen | C10283 | Cell counting |
| DMEM | Gibco by Life Sciences | 11995-065 | Cell culture |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 20 µl | Fisherbrand | 02-717-161 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 1000 µl | Fisherbrand | 02-717-166 | Cell culture |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses |
| Fluorescent Microscope | Advanced Microscopy Group (AMG) | Evos FL | Fluorescent imaging |
| Hydrogen Peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 | Positive control |
| Light Cube, Custom | Life Sciences | CUB0037 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm) |
| Light Cube, GFP | Thermo Scientific | AMEP4651 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm) |
| MDA-MB-231 | American Tissue Culture Collection | HTB-26 | Human epithelial breast cancer cell line |
| Microcentrifuge tubes, 2 ml | Grenier Bio-One | 623201 | Cell culture |
| PBS | Gibco by Life Sciences | 10010-023 | Cell culture |
| Pipet controller | Drummond | Hood Mate Model 360 | Cell culture |
| Serologycal pipet, 1 ml | Fisherbrand | 13-678-11B | Cell culture |
| Serologycal pipet, 5 ml | Fisherbrand | 13-678-11D | Cell culture |
| Serologycal pipet, 10 ml | Fisherbrand | 13-678-11E | Cell culture |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | HERACell 150i | CO2 incubator for cell culture |
| Trypan blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell counting |
References
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