הערכה של חמצון הסלולר באמצעות מערכת משנית ספציפי לחמצון-רגיש ירוק פלורסנט ירוקה
Summary
פרוטוקול זה מתאר את ההערכה של מצב החמצון הייחודי של תא משנה בתוך התא. בדיקה פלואורסצנטית תלויית-חמצון רגישה מאפשרת ניתוח טימטרי נוח בתאים שלמים.
Abstract
מדידת חמצון תאיים/הפחתת המאזן מספק סקירה של המצב הפיסיולוגי ו/או פתופסולוגית הסטטוס של אורגניזם. תיוולים חשובים במיוחד להארת המצב החדש של התאים באמצעות dithiol מופחת וביחס דיגומי. מהונדסים cysteine-המכיל חלבונים פלורסנט לפתוח עידן חדש לחמצון רגישות biosensors. אחד מהם, חלבון הניאון רגישות ירוק רגיש (רוfp), יכול בקלות להיות הציג לתאים עם התמרה ויראלי, המאפשר את מצב החמצון של תאי subcellular להיות מוערך מבלי לשבש את התהליכים הסלולריים. Cysteines מופחת ו cysteines תחמוצת של רוfp יש עירור מקסימה ב 488 ננומטר ו 405 nm, בהתאמה, עם פליטה ב 525 nm. הערכת היחס בין צורות מופחתות ומחמצנים מאפשרת חישוב נוח של איזון מחדש בתוך התא. במאמר שיטה זה, מונצח האדם האנושי משולשת שליליים סרטן השד תאים (מד א-MB-231) שימשו כדי להעריך את הסטטוס של חמצון בתוך התא החי. שלבי הפרוטוקול כוללים התמרה מד-התאים מספר 6-1-MB-231, הטיפול ב-H2O2, והערכה של היחס ציסטאין וציסטינה עם שתי הזרימה הציטונסות והמיקרוסקופיה הפלואורסצנטית.
Introduction
לחץ חמצוני הוגדר ב 1985 על ידי הלמוט שעירים כמו “הפרעה ב-prooxidant-מאזן נוגד חמצון לטובת לשעבר”1, ושפע של מחקר נערך כדי להשיג מחלות-, תזונה-, ו-הזדקנות-מעמד החיים ספציפי חמצון של אורגניזמים1,2,3. מאז, ההבנה של לחץ חמצוני הפך להיות רחב יותר. בדיקת השערות של שימוש נוגדי חמצון נגד מחלות ו/או הזדקנות הראו כי לחץ חמצוני לא רק גורם נזק אלא גם יש תפקידים אחרים בתאים. יתר על כן, מדענים הראו כי רדיקלים חופשיים לשחק תפקיד חשוב עבור התמרה אות2. כל מחקרים אלה מחזקים את החשיבות של קביעת השינויים הפחתת חמצון היחס של קרו. פעילות אנזימים, נוגדי חמצון ו/או חמצון, ומוצרי חמצון ניתן להעריך עם שיטות שונות. בין אלה, שיטות הקובעות חמצון תיול הם ללא ספק המשמשים ביותר משום שהם מדווחים על האיזון בין נוגדי חמצון ו prooxidants בתאים, כמו גם אורגניזמים4. במיוחד, היחס בין הגלוטתיון (gsh)/גלוטתיון קשר דיסולפידי (gssg) ו/או ציסטאין (cys)/cyסטינה (cyss) משמשים כסמנים לניטור מעמד החמצון של אורגניזמים2.
שיטות המשמשות לאמירת האיזון בין prooxidants ונוגדי חמצון להסתמך בעיקר על רמות של חלבונים מופחת/תחמוצת או מולקולות קטנות בתוך תאים. הכלים המערבי וספקטרומטר המסה משמשים כדי להעריך באופן כללי את היחס של מופחת/תחמוצת קרו (חלבון, שומנים וכו ‘), ו gsh/gssg יחס יכול להיות מוערך עם ספקטרופוטומטר5. תכונה נפוצה של שיטות אלה היא הנטייה הפיזית של המערכת על ידי הליזה תא ו/או רקמת המגון העור. מנתח אלה גם להיות מאתגרת כאשר יש צורך למדוד את מצב החמצון של תאים סלולריים שונים. כל אלה מרטבאליות לגרום לחפצים בסביבת העבודה.
החלבונים הניאון הרגישים מחדש פתחו עידן היתרון להערכת איזון החמצון מבלי לגרום להפרעה בתאים6. הם יכולים למקד תאים תאיים שונים, המאפשר כימות של פעילויות ספציפיות לחלקה (g., לומר את המצב החדש של המיטו, ואת הציטוסול) כדי לחקור את הקשר בין אורגלים סלולריים. חלבון פלורסנט צהוב (YFP), חלבון פלורסנט ירוק (GFP), וחלבונים HyPeR נבדקים על ידי מאייר ועמיתיו6. בין החלבונים האלה, החמצון הרגיש (gfp) הוא ייחודי עקב קריאות פלורסנט שונות של cys (ex. 488 ננומטר/em. 525 nm) ו-cyss (ex. 405 nm/525 nm) שאריות, אשר מאפשרת ניתוח של טימטרי, בניגוד לחלבונים אחרים הרגישים מפני חמצון כגון yfp7,8. פלט טימטרי הוא בעל ערך מכיוון שהוא מאזן את ההבדלים בין רמות הביטוי, הרגישויות לזיהוי והלבנתשמונה. תאי משנה של תאים (ציטוזול, המיטומטר, גרעין) או אורגניזמים שונים (חיידקים, כמו גם תאים ממיונקים) ניתן לפלח על ידי שינוי רוfp7,9,10.
הספר מבוצע באמצעות טכניקות הדמיה פלואורסצנטית, במיוחד עבור ניסויים חזותיים בזמן אמת. ניתוח ציטומטלי זרימה של “רומינטריק” ניתן גם לניסויים בנקודות זמן שנקבעו מראש. המאמר הנוכחי מתאר הן את השימוש של מיקרוסקופ פלורסנט ואת הזרימה cy, מנסה לבצע הערכה מחודשת של מעמד החמצון בתאי היונקים overexpressing (ממוקד ציטוסול) באמצעות התמרה ויראלית.
Protocol
Representative Results
Discussion
האיזון הטימלי/דיגופרתי באורגניזם משקף את מעמדם החדש של תאים. אורגניזמים חיים יש גלוטתיון, cysteine, החלבון thiols, ו נמוך מולקולרי משקל thiols, כולם מושפעים על ידי רמת החמצון ואת הד מעמד החמצון של תאים4. הנדסה מהונדסים לאפשר את הכמת הבלתי מפריעה של האיזון thiol/disulfide באמצעות שאריות CyS שלהם<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המבנה ו רקומביננטי אדנווירוס להבעת ציטוסול ספציפי מסוים בתאים נוצרו במעבדה של פול ט. שואקר, PhD, פרייברג בית הספר לרפואה, אוניברסיטת נורת’ווסטרן, ו ViraQuest Inc., בהתאמה. מחקר זה היה נתמך על ידי המרכז ללימודי תגובה מארחת לטיפול בסרטן המענק P20GM109005 דרך המכון הלאומי NIH של מרכזים למדעי הרפואה הכללית של מצוינות מחקר ביו-רפואי (COBRE כולשי), המכון הלאומי של מערכות מדעי הרפואה הכללית פרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה תוכנית ההכשרה מענק T32 GM106999, קרן UAMS/ הזרם cy, ליבת מתקן הליבה היה נתמך בחלקו על ידי המרכז לפתוגנזה ומארח תגובות דלקתיות להעניק P20GM103625 באמצעות הקצעם COBRE. התוכן הוא רק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של ה-NIH. ATA נתמכת על ידי מועצת המחקר המדעית והטכנולוגית של טורקיה (TUBITAK) 2214-מלגה.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Sciences | 25200-056 | Cell culture |
| 4-well chamber slide | Thermo Scientific | 154526 | Cell seeding material for fluorescent imaging |
| 5 ml tubes with cell strainer cap | Falcon | 352235 | Single cell suspension tube for flow cytometry analysis |
| 6-well plate | Corning | 353046 | Cell seeding material for flow cytometry analysis |
| 15 ml conical tubes | MidSci | C15B | Cell culture |
| 75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks | Corning | 4306414 | Cell culture |
| Adenoviral cytosol specific roGFP | ViraQuest | VQAd roGFP | roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker |
| Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | Cell culture |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting |
| Countess cell counter chamber slides | Invitrogen | C10283 | Cell counting |
| DMEM | Gibco by Life Sciences | 11995-065 | Cell culture |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 20 µl | Fisherbrand | 02-717-161 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 1000 µl | Fisherbrand | 02-717-166 | Cell culture |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses |
| Fluorescent Microscope | Advanced Microscopy Group (AMG) | Evos FL | Fluorescent imaging |
| Hydrogen Peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 | Positive control |
| Light Cube, Custom | Life Sciences | CUB0037 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm) |
| Light Cube, GFP | Thermo Scientific | AMEP4651 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm) |
| MDA-MB-231 | American Tissue Culture Collection | HTB-26 | Human epithelial breast cancer cell line |
| Microcentrifuge tubes, 2 ml | Grenier Bio-One | 623201 | Cell culture |
| PBS | Gibco by Life Sciences | 10010-023 | Cell culture |
| Pipet controller | Drummond | Hood Mate Model 360 | Cell culture |
| Serologycal pipet, 1 ml | Fisherbrand | 13-678-11B | Cell culture |
| Serologycal pipet, 5 ml | Fisherbrand | 13-678-11D | Cell culture |
| Serologycal pipet, 10 ml | Fisherbrand | 13-678-11E | Cell culture |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | HERACell 150i | CO2 incubator for cell culture |
| Trypan blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell counting |
References
- Sies, H. Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Jones, D. P. Redefining Oxidative Stress. Antioxidants & Redox Signalling. 8 (9-10), (2006).
- Pizzino, G., et al. Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 20117, 8416763 (2017).
- Go, Y. M., Jones, D. P. Thiol/disulfide redox states in signaling and sensing. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 48 (2), 173-191 (2013).
- Hansen, J. M., Go, Y., Jones, D. P. Nuclear and Mitochondrial Compartmentation of Oxidative Stress and Redox Signaling. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 46 (1), 215-234 (2006).
- Meyer, A. J., Dick, T. P. Fluorescent protein-based redox probes. Antioxidants and Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Björnberg, O., Østergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxidants and Redox Signaling. 8 (3-4), 354-361 (2006).
- Bhaskar, A., et al. Reengineering Redox Sensitive GFP to Measure Mycothiol Redox Potential of Mycobacterium tuberculosis during Infection. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003902 (2014).
- Loor, G., et al. Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1813 (7), 1382-1394 (2011).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Loor, G., et al. Menadione triggers cell death through ROS-dependent mechanisms involving PARP activation without requiring apoptosis. Free Radical Biology and Medicine. 49 (12), 1925-1936 (2010).
- Esposito, S., et al. Redox-sensitive GFP to monitor oxidative stress in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 28 (2), 133-144 (2017).
- Meyer, A. J., et al. Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer. Plant Journal. 52 (5), 973-986 (2007).
- Galvan, D. L., et al. Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy. Kidney International. 92 (5), 1282-1287 (2017).
- Swain, L., Nanadikar, M. S., Borowik, S., Zieseniss, A., Katschinski, D. M. Transgenic organisms meet redox bioimaging: One step closer to physiology. Antioxidants and Redox Signaling. 29 (6), 603-612 (2018).
- Gutscher, M., et al. Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology and Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
- Dey, S., Sidor, A., O’Rourke, B. Compartment-specific control of reactive oxygen species scavenging by antioxidant pathway enzymes. Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11185-11197 (2016).
