تقييم الأكسدة الخلوية باستخدام مقصورة فرعية خاصة ببروتين الفلورسنت الأخضر الحساس للأكسدة الحمراء
Summary
يصف هذا البروتوكول تقييم حالة الأكسدة الخاصة بالحجرة الفرعية داخل الخلية. يسمح مسبار الفلورسنت الحساس لل الأكسدة بالتحليل التناسبي المريح في الخلايا السليمة.
Abstract
قياس التوازن بين الخلايا الأكسدة / تخفيض يوفر لمحة عامة عن الحالة الأكسدة الفسيولوجية و / أو المرضية فيزيولوجيا للكائن الحي. ثيولس مهمة بشكل خاص لإلقاء الضوء على حالة الأكسدة من الخلايا عن طريق انخفاض ديثيول ونسبة كبريتيد المؤكد. البروتينات الفلورية المحتوية على السيستين المهندسة تفتح حقبة جديدة لمواسات الاستشعار الحيوي الحساسة للأحمر. واحد منهم، أحمر الأكسدة الخضراء البروتين الفلورسنت (roGFP)، يمكن بسهولة أن تدخل في الخلايا مع تحويل adenoviral، مما يسمح لحالة الأكسدة الحمراء من المقصورات دون الخلوية ليتم تقييمها دون تعطيل العمليات الخلوية. وقد cysteines انخفاض والسيستين المؤكد من roGFP استثارة ماكسيما في 488 نانومتر و 405 نانومتر، على التوالي، مع انبعاث في 525 نانومتر. تقييم نسب هذه الأشكال المخفضة والأكسدة يسمح حساب مريح لتوازن الأكسدة داخل الخلية. في هذه المقالة الطريقة، تم استخدام خلايا سرطان الثدي ثلاثية السلبية البشرية (MDA-MB-231) لتقييم حالة الأكسدة داخل الخلية الحية. وتشمل خطوات البروتوكول MDA-MB-231 خلية خط نقل مع الفيروس الغدي للتعبير عن cytosolic roGFP, العلاج مع H2O2,وتقييم نسبة السيستين والسيستين مع كل من تدفق الخلايا والمجهر الفلورسي.
Introduction
تم تعريف الإجهاد التأكسي في عام 1985 من قبل هيلموت سيز بأنه “اضطراب في التوازن prooxidant-antioxidant لصالح السابق”1، وقد تم إجراء عدد كبير من الأبحاث للحصول على المرض ، والتغذية ، والشيخوخة محددة حالة الأكسدة للكائنات الحية1،2،3. ومنذ ذلك الحين، أصبح فهم الإجهاد التأ المؤسدي أوسع نطاقاً. وقد أظهرت اختبار فرضيات استخدام المواد المضادة للاكسدة ضد الأمراض و / أو الشيخوخة أن الإجهاد التأسدي لا يسبب الضرر فحسب ولكن أيضا أدوار أخرى في الخلايا. وعلاوة على ذلك، فقد أظهر العلماء أن الجذور الحرة تلعب دورا هاما في نقل إشارة2. كل هذه الدراسات تعزيز أهمية تحديد التغيرات في خفض الأكسدة (الأكسدة الحمراء) نسبة الجزيئات الكبيرة. يمكن تقييم نشاط الانزيم ومضادات الأكسدة و / أو المواد المؤكدة ومنتجات الأكسدة بطرق مختلفة. من بين هذه الطرق التي تحدد أكسدة الثيول يمكن القول إن الأكثر استخداما لأنها تقرير عن التوازن بين المواد المضادة للاكسدة وprooxidants في الخلايا، وكذلك الكائنات الحية4. على وجه التحديد، وتستخدم النسب بين الجلوتاثيون (GSH)/الجلوتاثيون ثاني كبريتيد (GSSG) و / أو السيستين (CyS)/السيستين (CySS) كما المؤشرات الحيوية لرصد حالة الأكسدة الكائنات الحية2.
تعتمد الطرق المستخدمة في تحليل التوازن بين البروتوكسيدات ومضادات الأكسدة بشكل رئيسي على مستويات البروتينات المخفضة /المؤكدة أو الجزيئات الصغيرة داخل الخلايا. وتستخدم بقع الغربية وقياس الطيف الشامل لتقييم واسع النطاق نسب الجزيئات الجزئية المتقلصة/المؤكسدة (البروتين، الدهون الخ)، ويمكن تقييم نسب GSH/GSSG مع قياسالطيفي 5. ومن السمات المشتركة لهذه الطرق الانزعاج المادي للنظام عن طريق تجانس الخلايا و/أو الأنسجة. هذه التحليلات أيضاً تصبح صعبة عندما يكون من الضروري قياس حالة الأكسدة من مقصورات الخلوية المختلفة. كل هذه الانزعاجات تسبب التحف في بيئة الفحص.
فتحت البروتينات الفلورية الحساسة للريدox حقبة مفيدة لتقييم توازن الأكسدة الحمراء دون التسبب في اضطراب في الخلايا6. ويمكن أن تستهدف مقصورات مختلفة داخل الخلايا، مما يسمح بالتدبير الكمي للأنشطة الخاصة بالحجرة (على سبيل المثال، فحص حالة الأكسدة الحمراء للميتوكوندريا والسيتوزول) للتحقيق في المحادثات المتبادلة بين العضيات الخلوية. بروتين الفلورسنت الأصفر (YFP) ، البروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، والبروتينات HyPeR يتم استعراضها من قبل ماير وزملاؤه6. ومن بين هذه البروتينات، فإن GFP الحساسة للox (roGFP) فريدة من نوعها بسبب قراءات الفلورسنت المختلفة لCyS (488 نانومتر/م 525 نانومتر) وCySS (ex. 405 nm/525 nm) المخلفات، والتي تسمح التحليل النسب، على عكس البروتينات الأخرى الحساسة الأكسدة مثل YFP7،8. نسبة الناتج قيمة لأنه يوازن الفروق بين مستويات التعبير، وحساسيات الكشف، وphotobleaching8. يمكن استهداف مقصورات الخلايا الفرعية (السيتول ، الميتوكوندريا ، النواة) أو الكائنات الحية المختلفة (البكتيريا وكذلك خلايا الثدييات) عن طريق تعديل roGFP7،9،10.
وتجري مقايسات roGFP باستخدام تقنيات التصوير الفلورسنت، وخاصة بالنسبة لتجارب التصور في الوقت الحقيقي. إن التحليلات السيتوميترية لتدفق roGFPs ممكنة أيضًا للتجارب التي لها نقاط زمنية محددة مسبقًا. توضح المقالة الحالية استخدام المجهر الفلورسنت والتدفق للخلايا لإجراء تقييم نسبة لحالة الأكسدة الحمراء في الخلايا الثديية التعبير الزائد عن صوت roGFP (المستهدفة بالcytosol) عبر تحويل أدينوفيرال.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعكس توازن الثيول/ثاني كبريتيد في كائن حي حالة الأكسدة الحمراء للخلايا. الكائنات الحية لديها الجلوتاثيون، السيستين، thiols البروتين، وthols منخفضة الوزن الجزيئي، وكلها تتأثر بمستوى الأكسدة وتردي حالة الأكسدة من الخلايا4. 2006 2006 تسمح roGFPs المهندسة بالكم غير التخريبية لتوازن الثيول/…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم إنشاء بناء و المؤتلف الفيروس الأدينول للتعبير عن cytosol محددة roGFP في الخلايا في مختبر بول T. Schumacker, دكتوراه, فرايبرغ كلية الطب, جامعة نورث وسترن, وشركة ViraQuest, على التوالي. وقد دعمت هذه الدراسة من قبل مركز دراسات الاستجابة المضيفة لعلاج السرطان منحة P20GM109005 من خلال المعهد الوطني للصحة مراكز العلوم الطبية العامة من التميز البحوث الطبية الحيوية (COBRE NIGMS)، المعهد الوطني لأنظمة العلوم الطبية العامة الصيدلة وبرنامج التدريب على السموم منحة T32 GM106999، UAMS مؤسسة / جائزة الوقف البحوث الطبية AWD00053956، UAMS في نهاية العام جوائز المستشار AWD00053484. تم دعم مرفق القلب الأساسي للتدفق من قبل مركز الإمراض الميكروبية ومضيف الاستجابات الالتهابية منحة P20GM103625 من خلال COBRE NIGMS. والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحده ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية لل المعاهد القومية للصحة. وقد تم دعم المساعدة من قبل مجلس البحوث العلمية والتكنولوجية في تركيا (TUBITAK) 2214-A المنح الدراسية.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Sciences | 25200-056 | Cell culture |
| 4-well chamber slide | Thermo Scientific | 154526 | Cell seeding material for fluorescent imaging |
| 5 ml tubes with cell strainer cap | Falcon | 352235 | Single cell suspension tube for flow cytometry analysis |
| 6-well plate | Corning | 353046 | Cell seeding material for flow cytometry analysis |
| 15 ml conical tubes | MidSci | C15B | Cell culture |
| 75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks | Corning | 4306414 | Cell culture |
| Adenoviral cytosol specific roGFP | ViraQuest | VQAd roGFP | roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker |
| Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | Cell culture |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting |
| Countess cell counter chamber slides | Invitrogen | C10283 | Cell counting |
| DMEM | Gibco by Life Sciences | 11995-065 | Cell culture |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 20 µl | Fisherbrand | 02-717-161 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 1000 µl | Fisherbrand | 02-717-166 | Cell culture |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses |
| Fluorescent Microscope | Advanced Microscopy Group (AMG) | Evos FL | Fluorescent imaging |
| Hydrogen Peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 | Positive control |
| Light Cube, Custom | Life Sciences | CUB0037 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm) |
| Light Cube, GFP | Thermo Scientific | AMEP4651 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm) |
| MDA-MB-231 | American Tissue Culture Collection | HTB-26 | Human epithelial breast cancer cell line |
| Microcentrifuge tubes, 2 ml | Grenier Bio-One | 623201 | Cell culture |
| PBS | Gibco by Life Sciences | 10010-023 | Cell culture |
| Pipet controller | Drummond | Hood Mate Model 360 | Cell culture |
| Serologycal pipet, 1 ml | Fisherbrand | 13-678-11B | Cell culture |
| Serologycal pipet, 5 ml | Fisherbrand | 13-678-11D | Cell culture |
| Serologycal pipet, 10 ml | Fisherbrand | 13-678-11E | Cell culture |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | HERACell 150i | CO2 incubator for cell culture |
| Trypan blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell counting |
References
- Sies, H. Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Jones, D. P. Redefining Oxidative Stress. Antioxidants & Redox Signalling. 8 (9-10), (2006).
- Pizzino, G., et al. Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 20117, 8416763 (2017).
- Go, Y. M., Jones, D. P. Thiol/disulfide redox states in signaling and sensing. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 48 (2), 173-191 (2013).
- Hansen, J. M., Go, Y., Jones, D. P. Nuclear and Mitochondrial Compartmentation of Oxidative Stress and Redox Signaling. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 46 (1), 215-234 (2006).
- Meyer, A. J., Dick, T. P. Fluorescent protein-based redox probes. Antioxidants and Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Björnberg, O., Østergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxidants and Redox Signaling. 8 (3-4), 354-361 (2006).
- Bhaskar, A., et al. Reengineering Redox Sensitive GFP to Measure Mycothiol Redox Potential of Mycobacterium tuberculosis during Infection. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003902 (2014).
- Loor, G., et al. Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1813 (7), 1382-1394 (2011).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Loor, G., et al. Menadione triggers cell death through ROS-dependent mechanisms involving PARP activation without requiring apoptosis. Free Radical Biology and Medicine. 49 (12), 1925-1936 (2010).
- Esposito, S., et al. Redox-sensitive GFP to monitor oxidative stress in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 28 (2), 133-144 (2017).
- Meyer, A. J., et al. Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer. Plant Journal. 52 (5), 973-986 (2007).
- Galvan, D. L., et al. Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy. Kidney International. 92 (5), 1282-1287 (2017).
- Swain, L., Nanadikar, M. S., Borowik, S., Zieseniss, A., Katschinski, D. M. Transgenic organisms meet redox bioimaging: One step closer to physiology. Antioxidants and Redox Signaling. 29 (6), 603-612 (2018).
- Gutscher, M., et al. Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology and Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
- Dey, S., Sidor, A., O’Rourke, B. Compartment-specific control of reactive oxygen species scavenging by antioxidant pathway enzymes. Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11185-11197 (2016).
