Diferenciación neuronal de las células madre embrionarias del ratón in vitro
Summary
Aquí, establecimos un método de bajo costo y fácil de operar que dirige la diferenciación rápida y eficiente de las células madre embrionarias a las neuronas. Este método es adecuado para la popularización entre laboratorios y puede ser una herramienta útil para la investigación neurológica.
Abstract
La diferenciación neuronal de las células madre embrionarias del ratón (MESC) es una herramienta potencial para dilucidar los mecanismos clave implicados en la neurogénesis y potencialmente ayudar en la medicina regenerativa. Aquí, establecimos un método eficiente y de bajo costo para la diferenciación neuronal de los MESC invitro, utilizando la estrategia de cribado combinatorio. En las condiciones definidas aquí, la formación de cuerpos embrionados de 2 días + protocolo de inducción de ácido retinoico de 6 días permite una diferenciación rápida y eficiente de los mESC en células precursoras neuronales (NPC), como lo ve la formación de A2lox bien apilado y similar a un neurite y 129 derivados que son nestin positivos. El estado saludable de los cuerpos embrionarios y el punto de tiempo en el que se aplica el ácido retinoico (AR), así como las concentraciones de AR, son críticos en el proceso. En la diferenciación posterior de los PNJ en las neuronas, N2B27 medio II (complementado por medio neurobasal) podría apoyar mejor el mantenimiento a largo plazo y la maduración de las células neuronales. El método presentado es altamente eficiente, de bajo costo y fácil de operar, y puede ser una poderosa herramienta para la neurobiología y la investigación en biología del desarrollo.
Introduction
Las células madre embrionarias (ESC) son pluripotentes y pueden diferenciarse en células precursoras neuronales (NPC) y posteriormente en neuronas bajo ciertas condiciones1. La neurogénesis basada en ESC proporciona la mejor plataforma para imitar la neurogénesis, sirviendo así como una herramienta útil para estudios de biología del desarrollo y potencialmente ayuda en medicina regenerativa2,3. En las últimas décadas, muchas estrategias se han divulgado para inducir neurogénesis embrionaria, como el método transgénico4,utilizando moléculas pequeñas5,utilizando una matriz 3D microambiente6,y la técnica de co-cultivo7. Sin embargo, la mayoría de estos protocolos son condicionantes o difíciles de operar, por lo que no son adecuados para su uso en la mayoría de los laboratorios.
Para encontrar un método fácil de operar y de bajo costo para lograr una diferenciación neuronal eficiente de los mESC, aquí se utilizó una estrategia de cribado combinatoria. Como se describe en la Figura 1,todo el proceso de neurogénesis embrionaria se dividió en 2 fases. La Fase I se refiere al proceso de diferenciación de los MESC a los PNJ, y la fase II se relaciona con la diferenciación posterior de los PNJ en las neuronas. Sobre la base de los principios de fácil operación, bajo costo, materiales fácilmente disponibles y alta eficiencia de diferenciación, se eligieron siete protocolos en la Fase I y tres protocolos en la Fase II basados en el sistema tradicional de cultivo monocapa adherente o sistema de formación de cuerpos embrionados8,9. La eficiencia de diferenciación de los protocolos en ambas fases se evaluó utilizando la observación de morfología celular y el ensayo de inmunofluorescencia. Mediante la combinación del protocolo más eficiente de cada fase, establecimos el método optimizado para la diferenciación neuronal de los mESC.
Protocol
Representative Results
Discussion
En el presente estudio, establecimos un método simple y eficaz para la diferenciación neuronal de los mESC, con materiales de bajo costo y fácil obtención. En este método, 2 días de formación de cuerpos embrionados seguidos de 6 días de inducción por AR pueden promover eficazmente la diferenciación de los MESC en LOSP (Fase I-protocolo 3). Para la diferenciación de fase II, N2B27 medio II (Fase II-protocolo 3) más eficazmente inducen la diferenciación de los NPC en las neuronas. Para garantizar el éxito, se…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 31501099) y el Departamento de Educación Media y Joven de la Provincia de Hubei, China (No. Q20191104). Además, agradecemos al profesor Wensheng Deng de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Wuhan por proporcionar las líneas de células madre embrionarias del ratón A2lox.
Materials
| Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
| Coverslips | NEST | 801007 | |
| Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
| Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
| Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
| Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
| Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
| Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
| Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| 6 – well plate | Corning | 3516 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
| 15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |
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