Fare Embriyonik Kök Hücre in vitro nöronal farklılaşma
Summary
Burada embriyonik kök hücrelerden nöronlara hızlı ve verimli farklılaşmayı yönlendiren düşük maliyetli ve kullanımı kolay bir yöntem kurduk. Bu yöntem laboratuvarlar arasında popülerleşmeye uygundur ve nörolojik araştırmalar için yararlı bir araç olabilir.
Abstract
Fare embriyonik kök hücrelerinin (mESC’ ler) nöral farklılaşması, nörogenezde yer alan temel mekanizmaların aydınlatıcı ve rejeneratif tıbba potansiyel olarak yardımcı olan potansiyel bir araçtır. Burada, kombinatoryal tarama stratejisinikullanarak mESC in vitro’dan nöronal farklılaşma için verimli ve düşük maliyetli bir yöntem oluşturduk. Burada tanımlanan koşullar altında, 2 günlük embriyoid vücut oluşumu + 6 günlük retinoik asit indüksiyon protokolü, Nestin pozitif olan iyi istiflenmiş ve neurit benzeri A2lox ve 129 türevin oluşumunda görüldüğü gibi, MESC’lerden sinirsel öncül hücrelere (NPC’ ler) hızlı ve verimli bir şekilde farklılaşmaya izin sağlar. Embriyoid cisimlerin sağlıklı durumu ve retinoik asidin (RA) uygulandığı zaman noktası ve RA konsantrasyonları bu süreçte kritik öneme sahiptir. Daha sonraki NPC’lerden nöronlara farklılaşmada, N2B27 orta II (Nörobakal ortam tarafından desteklenmiştir) nöronal hücrelerin uzun süreli bakımını ve olgunlaşmasını daha iyi destekleyebilir. Sunulan yöntem yüksek verimlilik, düşük maliyetli ve kullanımı kolaydır ve nörobiyoloji ve gelişimsel biyoloji araştırmaları için güçlü bir araç olabilir.
Introduction
Embriyonik kök hücreler (ESC’ ler) pluripotenttir ve nöral öncül hücrelere (NPC’ ler) ve daha sonra belirli koşullar altında nöronlara farklılaşabilir1. ESC tabanlı nörogenez, nörogenez taklit etmek için en iyi platformu sağlar, böylece gelişimsel biyoloji çalışmaları için yararlı bir araç olarak hizmet eder ve rejeneratif tıpta potansiyel olarak yardımcıolunur 2,3. Son on yıllarda, transgenik yöntem 4 , küçük moleküller5,3Dmatris mikroçevrimi 6 ve ortak kültür tekniği7gibi embriyoniknörogenez indüklenmesi için birçok strateji bildirilmiştir. Bununla birlikte, bu protokollerin çoğu koşul sınırlı veya kullanımı zordur, bu nedenle çoğu laboratuvarda kullanım için uygun değildir.
MESC’lerden verimli nöral farklılaşma elde etmek için kullanımı kolay ve düşük maliyetli bir yöntem bulmak için burada bir kombinatoryal tarama stratejisi kullanılmıştır. Şekil 1’deaçıklandığı gibi embriyonik nörogenezin tüm süreci 2 faza ayrılmıştır. Aşama I, MESC’lerden NPC’lere farklılaşma sürecini ifade eder ve faz II, NPC’lerden nöronlara sonraki farklılaşma ile ilgilidir. Kolay kullanım, düşük maliyetli, kolay kullanılabilen malzemeler ve yüksek farklılaşma verimliliği ilkelerine dayanarak, Geleneksel yapışık monolayer kültür sistemine veya embriyoid vücut oluşum sistemine göre Faz I’de yedi protokol ve Faz II’de üç protokol seçilmiştir8,9. Her iki fazda da protokollerin farklılaşma verimliliği hücre morfolojisi gözlemi ve immünofluoresans tahlilleri kullanılarak değerlendirildi. Her aşamanın en verimli protokolünü birleştirerek, mESC’lerden nöral farklılaşma için optimize edilmiş yöntemi oluşturduk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, düşük maliyetli ve kolayca elde edilen malzemelerle, mESC’lerden nöronal farklılaşma için basit ve etkili bir yöntem oluşturduk. Bu yöntemde, 2 günlük embriyoid vücut oluşumu ve ardından 6 günlük RA indüksiyonu, MESC’lerin NPC’lere farklılaştırılmasını etkili bir şekilde teşvik edebilir (Faz I-protokolü 3). Faz II farklılaşması için, N2B27 orta II (Faz II-protokol 3) NPC’lerden nöronlara farklılaşmayı en etkili şekilde teşvik eder. Başarıyı sağlamak için birkaç …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 31501099) ve Hubei Eyaleti Eğitim Departmanı Orta Yaşlı ve Genç (No. Q20191104). Wuhan Bilim ve Teknoloji Üniversitesi’nden Profesör Wensheng Deng’e fare embriyonik kök hücre çizgileri A2lox’u sağladığı için teşekkür ederiz.
Materials
| Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
| Coverslips | NEST | 801007 | |
| Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
| Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
| Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
| Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
| Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
| Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
| Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| 6 – well plate | Corning | 3516 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
| 15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |
References
- Vieira, M. S., et al. Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications. Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).
- Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. Application of embryonic stem cells on Parkinson’s disease therapy. Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).
- Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).
- Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene. Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).
- Yoshimatsu, S., et al. Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs. Neuroscience research. , (2019).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).
- Gazina, E. V., et al. Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks. Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).
- Ohnuki, Y., Kurosawa, H. Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).
- Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture. Journal of Visualized experiments. (99), e52823 (2015).
- Li, Y., et al. An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486 (2020).
- Zhou, P., et al. Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method. Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).
- Lu, J. F., et al. All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways. BMC Cell Biology. 10, 57 (2009).
- Kanungo, J. Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).
- Rochette-Egly, C. Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).
- Wang, R., et al. Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism. Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).
- Wu, H. B., et al. Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells. Cell Death Disease. 8, 2953 (2017).
- Chen, W., et al. Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).
- Nakayama, Y., et al. A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line. Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), 16174 (2011).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).
