التمايز العصبي من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في المختبر
Summary
هنا، أنشأنا طريقة منخفضة التكلفة وسهلة التشغيل التي توجه التمايز السريع والفعال من الخلايا الجذعية الجنينية إلى الخلايا العصبية. هذه الطريقة مناسبة لتعميم بين المختبرات ويمكن أن تكون أداة مفيدة للبحوث العصبية.
Abstract
التمايز العصبي للخلايا الجذعية الجنينية الماوس (mESCs) هو أداة محتملة لتوضيح الآليات الرئيسية المشاركة في تكوين الخلايا العصبية ويحتمل أن تساعد في الطب التجديدي. هنا، أنشأنا طريقة فعالة ومنخفضة التكلفة للتمايز العصبي من mESCs في المختبر، باستخدام استراتيجية الفرز الجمعي. في ظل الظروف المحددة هنا، فإن تكوين الجسم الجنيني لمدة يومين + بروتوكول تحريض حمض الريتينويك لمدة 6 أيام يسمح بالتمايز السريع والفعال من الـ mESCs إلى خلايا السلائف العصبية (NPCs)، كما يتضح من تشكيل A2lox و129 مشتقة من النستين المرصوفة بشكل جيد والنوريت الشبيهة بالنيوتريت و129 مشتقًا إيجابيًا. الحالة الصحية للأجسام الجنينية ونقطة الوقت التي يتم فيها تطبيق حمض الريتينويك (RA) ، وكذلك تركيزات RA ، أمر حاسم في هذه العملية. في التمايز اللاحق من NPCs إلى الخلايا العصبية، N2B27 المتوسطة II (تكملها متوسطة العصبية) يمكن أن تدعم بشكل أفضل الصيانة على المدى الطويل ونضوج الخلايا العصبية. الطريقة المعروضة هي الكفاءة العالية ، وانخفاض التكلفة وسهلة التشغيل ، ويمكن أن تكون أداة قوية لبحوث البيولوجيا العصبية والتنمية البيولوجية.
Introduction
الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) هي متعددة القدرات ويمكن أن تفرق إلى الخلايا السليفة العصبية (NPCs) وبعد ذلك إلى الخلايا العصبية في ظل ظروف معينة1. يوفر تكوين الخلايا العصبية القائم على ESC أفضل منصة لمحاكاة النشوء العصبي ، وبالتالي بمثابة أداة مفيدة لدراسات البيولوجيا التنموية ويحتمل أن تساعد في الطب التجديدي2،3. في العقود الماضية، وقد تم الإبلاغ عن العديد من الاستراتيجيات لتحفيز تكوين جيني الجنين، مثل طريقة المعدلة وراثيا4، باستخدام جزيئات صغيرة5، وذلك باستخدام مصفوفة 3D microenvironment6، و شارك في ثقافة تقنية7. ومع ذلك، فإن معظم هذه البروتوكولات إما محدودة أو صعبة التشغيل، وبالتالي فهي غير مناسبة للاستخدام في معظم المختبرات.
للعثور على طريقة سهلة التشغيل ومنخفضة التكلفة لتحقيق تمايز عصبي فعال من mESCs ، تم استخدام استراتيجية فحص الجمع بين الدمج هنا. كما هو موضح في الشكل 1، تم تقسيم العملية الكاملة من النشوء العصبي الجنيني إلى مرحلتين. وتشير المرحلة الأولى إلى عملية التمايز بين الـ mESCs إلى NPCs، وتتعلق المرحلة الثانية بالتمايز اللاحق من NPCs إلى الخلايا العصبية. استنادا إلى مبادئ عملية سهلة، وانخفاض تكلفة، والمواد المتاحة بسهولة وكفاءة عالية التمايز، تم اختيار سبعة بروتوكولات في المرحلة الأولى وثلاثة بروتوكولات في المرحلة الثانية على أساس نظام ثقافة أحادية الطبقات التقليدية أو نظام تكوين الجسم الجنينية8،9. وتم تقييم كفاءة التمايز في البروتوكولات في كلتا المرحلتين باستخدام الملاحظة مورفولوجيا الخلية و قياس المناعة. من خلال الجمع بين البروتوكول الأكثر كفاءة في كل مرحلة ، أنشأنا الطريقة المثلى للتمايز العصبي من mESCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، أنشأنا طريقة بسيطة وفعالة للتمايز العصبي من mESCs، مع انخفاض تكلفة والمواد التي تم الحصول عليها بسهولة. في هذه الطريقة، 2 أيام من تكوين الجسم الجنينية تليها 6 أيام من تحريض RA يمكن أن تعزز بشكل فعال التفريق بين mESCs إلى NPCs (المرحلة الأولى البروتوكول 3). بالنسبة للمرحلة الثانية من ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية الصينية للعلوم الطبيعية (رقم 31501099) و”متوسط العمر” و”يونغ” من إدارة التعليم في مقاطعة هوبى، الصين (رقم 110099) Q20191104). ونشكر البروفيسور ونشينغ دينغ في جامعة ووهان للعلوم والتكنولوجيا على توفير خطوط الخلايا الجذعية الجنينية الماوس A2lox.
Materials
| Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
| Coverslips | NEST | 801007 | |
| Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
| Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
| Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
| Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
| Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
| Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
| Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| 6 – well plate | Corning | 3516 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
| 15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |
References
- Vieira, M. S., et al. Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications. Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).
- Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. Application of embryonic stem cells on Parkinson’s disease therapy. Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).
- Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).
- Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene. Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).
- Yoshimatsu, S., et al. Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs. Neuroscience research. , (2019).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).
- Gazina, E. V., et al. Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks. Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).
- Ohnuki, Y., Kurosawa, H. Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).
- Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture. Journal of Visualized experiments. (99), e52823 (2015).
- Li, Y., et al. An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486 (2020).
- Zhou, P., et al. Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method. Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).
- Lu, J. F., et al. All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways. BMC Cell Biology. 10, 57 (2009).
- Kanungo, J. Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).
- Rochette-Egly, C. Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).
- Wang, R., et al. Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism. Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).
- Wu, H. B., et al. Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells. Cell Death Disease. 8, 2953 (2017).
- Chen, W., et al. Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).
- Nakayama, Y., et al. A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line. Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), 16174 (2011).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).
