התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה
Summary
כאן, הקמנו שיטה זולה וקלה לתפעול המכוונת בידול מהיר ויעיל מתאי גזע עובריים לנוירונים. שיטה זו מתאימה לפופולאריזציה בקרב מעבדות ויכולה להיות כלי שימושי למחקר נוירולוגי.
Abstract
הבידול העצבי של תאי גזע עובריים של העכבר (mESCs) הוא כלי פוטנציאלי להבהיר את מנגנוני המפתח המעורבים נוירוגנזה ופוטנציאל לסייע ברפואה רגנרטיבית. כאן, הקמנו שיטה יעילה בעלות נמוכה עבור בידול עצבי מ mESCs במבחנה, באמצעות האסטרטגיה של הקרנה קומבינטורית. בתנאים המוגדרים כאן, היווצרות הגוף העוברי בן היומיים + פרוטוקול אינדוקציה של חומצה רטינואית למשך 6 ימים מאפשרת בידול מהיר ויעיל של MESCs לתאי מבשר עצביים (NPCs), כפי שניתן לראות על ידי היווצרות של A2lox מוערמים היטב דמויי נויריט ו -129 נגזרות שהן חיוביות של נסטין. המצב הבריא של גופים עובריים ואת נקודת הזמן שבה חומצה רטינואית (RA) מוחל, כמו גם ריכוזי RA, הם קריטיים בתהליך. בהבחנה הבאה מ NPCs לתוך נוירונים, N2B27 בינוני II (בתוספת מדיום Neurobasal) יכול לתמוך טוב יותר תחזוקה לטווח ארוך והתבגרות של תאים עצביים. השיטה המוצגת היא יעילה מאוד, בעלות נמוכה וקלה לתפעול, ויכולה להיות כלי רב עוצמה למחקר נוירוביולוגי וביולוגיה התפתחותית.
Introduction
תאי גזע עובריים (ESCs) הם פלוריפוטנטיים ויכולים להבדיל לתאי מבשר עצביים (NPCs) ולאחר מכן לנוירונים בתנאים מסוימים1. נוירוגנזה מבוססת ESC מספקת את הפלטפורמה הטובה ביותר לחקות נוירוגנזה, ובכך לשמש כלי שימושי למחקרים ביולוגיים התפתחותיים וסיוע פוטנציאלי ברפואה רגנרטיבית2,3. בעשורים האחרונים, אסטרטגיות רבות דווחו על גרימת נוירוגנזה עוברית, כגון השיטה הטרנסגנית4, באמצעות מולקולות קטנות5, באמצעות microenvironment מטריצה 3D6, ואת טכניקת תרבות משותפת7. עם זאת, רוב הפרוטוקולים האלה הם גם תנאי מוגבל או קשה לתפעול, ולכן הם אינם מתאימים לשימוש ברוב המעבדות.
כדי למצוא שיטה קלה לתפעול ועלות נמוכה להשגת בידול עצבי יעיל מ- mESCs, נעשה כאן שימוש באסטרטגיית סינון קומבינטורית. כפי שמתואר באיור 1, כל התהליך של נוירוגנזה עוברית חולק לשני שלבים. שלב I מתייחס לתהליך הבידול מ- mESCs ל- NPCs, והשלב השני מתייחס להבחנה הבאה מ- NPCs לנוירונים. בהתבסס על עקרונות הפעולה הקלה, עלות נמוכה, חומרים זמינים בקלות ויעילות בידול גבוהה, שבעה פרוטוקולים בשלב I ושלושה פרוטוקולים בשלב II נבחרו על סמך מערכת התרבות המונולאייה המסורתית או מערכת היווצרות הגוף העוברי8,9. יעילות הבידול של פרוטוקולים בשני השלבים הוערכה באמצעות תצפית מורפולוגיה של התא ומבחן כשל חיסוני. באמצעות שילוב הפרוטוקול היעיל ביותר של כל שלב, הקמנו את השיטה האופטימלית לבידול עצבי מ- mESCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר הנוכחי, הקמנו שיטה פשוטה ויעילה עבור בידול עצבי מ mESCs, עם עלות נמוכה וחומרים שהושגו בקלות. בשיטה זו, 2 ימים של היווצרות הגוף העוברי ואחריו 6 ימים של אינדוקציה RA יכול לקדם ביעילות את הבידול של mESCs לתוך NPCs (שלב I-פרוטוקול 3). עבור הבידול שלב II, N2B27 בינוני II (שלב II-פרוטוקול 3) ביעילות רבה לגרום את…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ‘31501099) ואת בגיל העמידה וצעיר של מחלקת החינוך של מחוז חוביי, סין (לא. רבעון 20191104). כמו כן, אנו מודים לפרופסור וונשנג דנג מאוניברסיטת ווהאן למדע וטכנולוגיה על שסיפק את קווי תאי הגזע העובריים של העכבר A2lox.
Materials
| Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
| Coverslips | NEST | 801007 | |
| Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
| Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
| Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
| Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
| Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
| Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
| Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| 6 – well plate | Corning | 3516 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
| 15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |
References
- Vieira, M. S., et al. Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications. Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).
- Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. Application of embryonic stem cells on Parkinson’s disease therapy. Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).
- Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).
- Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene. Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).
- Yoshimatsu, S., et al. Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs. Neuroscience research. , (2019).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).
- Gazina, E. V., et al. Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks. Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).
- Ohnuki, Y., Kurosawa, H. Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).
- Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture. Journal of Visualized experiments. (99), e52823 (2015).
- Li, Y., et al. An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486 (2020).
- Zhou, P., et al. Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method. Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).
- Lu, J. F., et al. All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways. BMC Cell Biology. 10, 57 (2009).
- Kanungo, J. Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).
- Rochette-Egly, C. Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).
- Wang, R., et al. Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism. Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).
- Wu, H. B., et al. Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells. Cell Death Disease. 8, 2953 (2017).
- Chen, W., et al. Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).
- Nakayama, Y., et al. A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line. Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), 16174 (2011).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).
