Neuronale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in vitro
Summary
Hier hebben we een goedkope en eenvoudig te bedienen methode opgezet die een snelle en efficiënte differentiatie van embryonale stamcellen naar neuronen stuurt. Deze methode is geschikt voor popularisering onder laboratoria en kan een nuttig hulpmiddel zijn voor neurologisch onderzoek.
Abstract
De neurale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen (mESCs) is een potentieel hulpmiddel om de belangrijkste mechanismen die betrokken zijn bij neurogenese op te helderen en mogelijk te helpen bij regeneratieve geneeskunde. Hier hebben we een efficiënte en goedkope methode voor neuronale differentiatie van mESCs in vitroopgezet, met behulp van de strategie van combinatorische screening. Onder de hier gedefinieerde omstandigheden maakt het 2-daagse embryoide lichaamsvorming + 6-daags retinoïnezuurinductieprotocol een snelle en efficiënte differentiatie van mESCs in neurale precursorcellen (NPC’s) mogelijk, zoals blijkt uit de vorming van goed gestapelde en neurietachtige A2lox en 129 derivaten die Nestine-positief zijn. De gezonde toestand van embryonale lichamen en het tijdstip waarop retinoïnezuur (RA) wordt toegepast, evenals de RA-concentraties, zijn daarbij van cruciaal belang. In de daaropvolgende differentiatie van NPC’s in neuronen zou N2B27 medium II (aangevuld met Neurobasal medium) het onderhoud en de rijping van neuronale cellen op lange termijn beter kunnen ondersteunen. De gepresenteerde methode is zeer efficiënt, goedkoop en eenvoudig te bedienen en kan een krachtig hulpmiddel zijn voor neurobiologie en ontwikkelingsbiologieonderzoek.
Introduction
Embryonale stamcellen (ECC’s) zijn pluripotent en kunnen zich onder bepaalde omstandigheden onderscheiden in neurale precursorcellen (NPC’s) en vervolgens in neuronen1. ESC-gebaseerde neurogenese biedt het beste platform om neurogenese na te bootsen, en dient zo als een nuttig hulpmiddel voor ontwikkelingsbiologische studies en mogelijk hulp bij regeneratieve geneeskunde2,3. In de afgelopen decennia zijn veel strategieën gerapporteerd voor het induceren van embryonale neurogenese, zoals de transgene methode4, met behulp van kleinemoleculen 5, met behulp van een 3D-matrix micromilieu6, en de co-cultuurtechniek7. De meeste van deze protocollen zijn echter beperkt of moeilijk te bedienen, dus ze zijn niet geschikt voor gebruik in de meeste laboratoria.
Om een eenvoudig te bedienen en goedkope methode te vinden om efficiënte neurale differentiatie van mESCs te bereiken, werd hier een combinatorische screeningstrategie gebruikt. Zoals beschreven in figuur 1,was het hele proces van embryonale neurogenese verdeeld in 2 fasen. Fase I verwijst naar het differentiatieproces van mESC’s naar NPC’s, en fase II heeft betrekking op de daaropvolgende differentiatie van NPC’s in neuronen. Op basis van de principes van eenvoudige bediening, lage kosten, gemakkelijk beschikbare materialen en een hoge differentiatie-efficiëntie, werden zeven protocollen in fase I en drie protocollen in fase II gekozen op basis van het traditionele aanhankelijke monolaagcultuursysteem of embryooïde lichaamsvormingssysteem8,9. De differentiatie-efficiëntie van protocollen in beide fasen werd geëvalueerd met behulp van celmorfologieobservatie en immunofluorescentietest. Door het meest efficiënte protocol van elke fase te combineren, hebben we de geoptimaliseerde methode voor neurale differentiatie van mESCs vastgesteld.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie hebben we een eenvoudige en effectieve methode voor neuronale differentiatie van mESCs vastgesteld, met lage kosten en gemakkelijk te verkrijgen materialen. Bij deze methode kunnen 2 dagen embryoide lichaamsvorming gevolgd door 6 dagen RA-inductie de differentiatie van mESC’s in NPC’s effectief bevorderen (fase I-protocol 3). Voor de fase II-differentiatie induceert N2B27 medium II (Fase II-protocol 3) het meest effectief de differentiatie van NPC’s in neuronen. Om succes te garanderen, moet meer aandacht …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 31501099) en de middelbare leeftijd en jongeren van het ministerie van Onderwijs van de provincie Hubei, China (nr. Het jaar 20191104). En we danken professor Wensheng Deng van wuhan University of Science and Technology voor het leveren van de muis embryonale stamcellijnen A2lox.
Materials
| Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
| Coverslips | NEST | 801007 | |
| Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
| Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
| Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
| Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
| Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
| Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
| Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| 6 – well plate | Corning | 3516 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
| 15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |
References
- Vieira, M. S., et al. Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications. Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).
- Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. Application of embryonic stem cells on Parkinson’s disease therapy. Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).
- Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).
- Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene. Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).
- Yoshimatsu, S., et al. Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs. Neuroscience research. , (2019).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).
- Gazina, E. V., et al. Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks. Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).
- Ohnuki, Y., Kurosawa, H. Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).
- Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture. Journal of Visualized experiments. (99), e52823 (2015).
- Li, Y., et al. An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486 (2020).
- Zhou, P., et al. Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method. Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).
- Lu, J. F., et al. All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways. BMC Cell Biology. 10, 57 (2009).
- Kanungo, J. Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).
- Rochette-Egly, C. Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).
- Wang, R., et al. Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism. Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).
- Wu, H. B., et al. Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells. Cell Death Disease. 8, 2953 (2017).
- Chen, W., et al. Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).
- Nakayama, Y., et al. A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line. Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), 16174 (2011).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).
