Différenciation neuronale des cellules souches embryonnaires de souris in vitro
Summary
Ici, nous avons établi une méthode peu coûteux et facile à utiliser qui dirige la différenciation rapide et efficace des cellules souches embryonnaires en neurones. Cette méthode convient à la vulgarisation entre les laboratoires et peut être un outil utile pour la recherche neurologique.
Abstract
La différenciation neuronale des cellules souches embryonnaires de souris (MESCs) est un outil potentiel pour élucider les mécanismes clés impliqués dans la neurogenèse et potentiellement aider à la médecine régénérative. Ici, nous avons mis en place une méthode efficace et peu coûteux pour la différenciation neuronale des MESCs in vitro, en utilisant la stratégie de dépistage combinatoire. Dans les conditions définies ici, la formation du corps embryoïde de 2 jours + protocole d’induction de l’acide rétinoïque de 6 jours permet une différenciation rapide et efficace des MESC en cellules précurseurs neuronales (PNJ), comme en est la formation d’A2lox bien empilés et neurites et de 129 dérivés positifs à Nestin. L’état sain des corps embryoïdes et le moment où l’acide rétinoïque (PR) est appliqué, ainsi que les concentrations de PR, sont essentiels dans le processus. Dans la différenciation subséquente des PNJ en neurones, N2B27 medium II (complété par le milieu neurobasal) pourrait mieux soutenir le maintien et la maturation à long terme des cellules neuronales. La méthode présentée est très efficace, peu coûteux et facile à utiliser, et peut être un outil puissant pour la neurobiologie et la recherche en biologie du développement.
Introduction
Les cellules souches embryonnaires (ESC) sont pluripotentes et peuvent se différencier en cellules précurseurs neuronales (PNJ) puis en neurones dans certaines conditions1. La neurogenèse basée sur l’ESC fournit la meilleure plate-forme pour imiter la neurogenèse, servant ainsi d’outil utile pour des études de biologie développementale et potentiellement aider à la médecinerégénérative 2,3. Au cours des dernières décennies, de nombreuses stratégies ont été rapportées pour induire la neurogenèse embryonnaire, comme la méthode transgénique4, en utilisant de petites molécules5, en utilisant un microenvironnement matricielle 3D6, et la technique de co-culture7. Cependant, la plupart de ces protocoles sont soit condition limitée ou difficile à utiliser, de sorte qu’ils ne sont pas adaptés à une utilisation dans la plupart des laboratoires.
Pour trouver une méthode facile à utiliser et peu coûteux pour parvenir à une différenciation neuronale efficace des MESC, une stratégie de dépistage combinatoire a été utilisée ici. Tel que décrit dans la figure 1, tout le processus de neurogenèse embryonnaire a été divisé en 2 phases. La phase I se réfère au processus de différenciation des MESC en PNJ, et la phase II se rapporte à la différenciation subséquente des PNJ en neurones. Sur la base des principes du fonctionnement facile, du faible coût, des matériaux facilement disponibles et de l’efficacité de différenciation élevée, sept protocoles de phase I et trois protocoles de phase II ont été choisis en fonction du système traditionnel de culture monocouche adhérente ou du système de formation du corpsembryoïde 8,9. L’efficacité de différenciation des protocoles dans les deux phases a été évaluée utilisant l’observation de morphologie cellulaire et l’essai d’immunofluorescence. En combinant le protocole le plus efficace de chaque phase, nous avons établi la méthode optimisée pour la différenciation neuronale des MESCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans la présente étude, nous avons établi une méthode simple et efficace pour la différenciation neuronale des MESCs, avec des matériaux peu coûteux et facilement obtenus. Dans cette méthode, 2 jours de formation du corps embryoïde suivis de 6 jours d’induction de la PR peuvent effectivement favoriser la différenciation des MESC en PNJ (phase I-protocole 3). Pour la différenciation de phase II, N2B27 medium II (Phase II-protocol 3) induit le plus efficacement la différenciation des PNJ en neurones. Pour ass…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China (n° 31501099) et les personnes d’âge moyen et les jeunes du département de l’éducation de la province du Hubei, en Chine (no. Q20191104). Et, nous remercions le professeur Wensheng Deng de l’Université des sciences et de la technologie de Wuhan pour avoir fourni les lignées de cellules souches embryonnaires de souris A2lox.
Materials
| Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
| Coverslips | NEST | 801007 | |
| Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
| Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
| Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
| Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
| Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
| Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
| Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| 6 – well plate | Corning | 3516 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
| 15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |
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