منع تدفق اللمفاوية عن طريق خياطة الأوعية اللمفاوية Afferent في الفئران
Summary
يتم تقديم بروتوكول لمنع تدفق اللمفية عن طريق خياطة جراحية من الأوعية اللمفاوية afferent.
Abstract
الأوعية اللمفاوية حاسمة في الحفاظ على توازن سوائل الأنسجة وتحسين الحماية المناعية عن طريق نقل المستضدات، السيتوكينات، والخلايا إلى استنزاف الغدد الليمفاوية (LNs). انقطاع تدفق اللمفية هو وسيلة هامة عند دراسة وظيفة الأوعية اللمفاوية. الأوعية اللمفاوية الموفاوية من اللوحات اللمفية المورين إلى الغدد الليمفاوية الزفيرة (pLNs) هي محددة جيداً على أنها الطرق الوحيدة لتصريف الغدد الليمفاوية في النفصال. يمكن خياطة هذه الأوعية اللمفاوية afferent منع تدفق اللمفية بشكل انتقائي إلى pLNs. هذه الطريقة تسمح للتدخل في تدفق الليمفاوية مع الحد الأدنى من الضرر للخلايا البطانية اللمفاوية في التصريف pLN، والأوعية اللمفاوية afferent، فضلا عن غيرها من الأوعية اللمفاوية في جميع أنحاء المنطقة. وقد استخدمت هذه الطريقة لدراسة كيفية تأثير اللمفية على النفّة الغدد الليمفاوية العالية (HEV) والتعبير chemokine في LN، وكيف تتدفق اللمفية من خلال الأنسجة الدهنية المحيطة LN في غياب الأوعية اللمفاوية الوظيفية. مع الاعتراف المتزايد لأهمية وظيفة اللمفاوية، وسوف يكون لهذه الطريقة تطبيقات أوسع لزيادة كشف وظيفة الأوعية اللمفاوية في تنظيم البيئة الدقيقة LN والاستجابات المناعية.
Introduction
يوفر التنظيم المكاني للنظام اللمفاوي الدعم الهيكلي والوظيفي لإزالة السوائل خارج الخلية ومضادات النقل والخلايا التي تقدم المستضدات (APCs) إلى LNs المستنزفة. الأوعية اللمفاوية الأولية (تسمى أيضا الشعيرات الدموية اللمفاوية) هي نفاذية للغاية بسبب تقاطعاتها بين الخلايا غير المترابطة ، والتي تسهل جمع فعال من السوائل والخلايا وغيرها من المواد من المساحات خارج الخلية المحيطة1. الأوعية اللمفاوية الأولية دمج في جمع الأوعية اللمفاوية، والتي لديها تقاطعات ضيقة بين الخلايا، وغشاء الطابق السفلي المستمر، وتغطية العضلات اللمفاوية. جمع الأوعية اللمفاوية هي المسؤولة عن نقل اللمف التي تم جمعها إلى LNs استنزاف والعودة في نهاية المطاف الليمفاوية إلى الدورة الدموية2،3. والأوعية اللمفاوية جمع التي تدفع الليمفاوية في LN استنزاف هي الأوعية اللمفاويةafferent 4,5,6,7. يمكن عرقلة الأوعية اللمفاوية afferent منع تدفق اللمفية في LNs، وهو أسلوب مفيد عند دراسة وظيفة تدفق الليمفاوية.
وقد أظهرت الدراسات السابقة أن تدفق اللمفية يلعب دورا هاما في نقل المستضدات و APCs، فضلا عن الحفاظ على التوازن LN. ومن المفهوم جيدا أن المركبات المضادة للأفراد المشتقة من الأنسجة، التي تنشط عادةً الخلايا التشعبية المهاجرة (DCs)، تنتقل عبر الأوعية اللمفاوية المنتقلة إلى LN لتنشيط الخلايا التائية8. فكرة أن مستضدات حرة الشكل، مثل الميكروبات أو المستضدات القابلة للذوبان، تدفق سلبي مع الليمفاوية إلى LN لتنشيط LN المقيم APCs وقد تم الحصول على القبول في العقد الماضي9،10،11،12. مستضدات الشكل الحر السفر مع الليمفاوية يستغرق دقائق بعد العدوى للسفر إلى LN، وتفعيل الخلية المقيم LN قد تحدث في غضون 20 دقيقة بعد التحفيز. هذا هو أسرع بكثير من تفعيل DCs المهاجرة ، والتي تأخذ أكثر من 8 ح لدخول 9LNاستنزاف . بالإضافة إلى نقل المستضدات لبدء الحماية المناعية ، تحمل اللمفية أيضًا السيتوكينات وCS إلى LN للحفاظ على البيئة الدقيقة ، ودعم الخلايا المناعية13،14. سابقا، منع تدفق اللمفية عن طريق خياطة الأوعية اللمفاوية afferent أظهرت أن الليمفاوية مطلوب للحفاظ على النمط الظاهري HEV المطلوبة لدعم خلية T homeostatic وB خلية توجيه إلى LN15،16،17. CCL21 هو chemokine الحرجة التي توجه DC و T الخلية تحديد المواقع في LN8،18. حظر تدفق اللمفية يقطع تعبير CCL21 في LN ومن المحتمل أن ينقطع DC و T الخلية تحديد المواقع و/أو التفاعل فيLN 19. وهكذا، يمكن حظر تدفق الليمفاوية بشكل مباشر أو غير مباشر إلغاء مستضد / DC الوصول إلى LN استنزاف عن طريق تعطيل البيئة الدقيقة LN التي تنظم الاستجابات المناعية في LN. لتحقيق أفضل وظيفة تدفق الليمفاوية، يتم تقديم بروتوكول تجريبي (الشكل 1) لمنع تدفق اللمفية في الفئران عن طريق خياطة الأوعية اللمفاوية afferent من لوحة القدم إلى pLN. يمكن أن تكون هذه الطريقة تقنية مهمة للدراسات المستقبلية حول وظيفة اللمفاوية في الحالات الصحية والمُرضى.
Protocol
Representative Results
Discussion
سيكون لحجب تدفق اللمفية تطبيقات واسعة في معالجة تسليم المستضد إلى LN في ظروف صحية ومريضة. من الممكن استخدام هذه الطريقة للتحكم في توقيت تسليم المستضد من أجل دراسة كيفية استمرار تدفق الليمفاوية ينظم الاستجابة المناعية في استنزاف LNs. ويمكن أيضاً استخدام هذه الطريقة لانقطاع تدفق اللمفية لدرا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون آفا زاردينشاد على تدقيقها في المخطوطة. ويدعم هذا العمل المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR، PJT-156035)، والمؤسسة الكندية للابتكار من أجل SL (32930)، والمؤسسة الوطنية الصينية للعلوم الطبيعية ليوخيا لين (81901576).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
References
- Pflicke, H., Sixt, M. Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).
- Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).
- Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle. Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).
- Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph. The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).
- Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels. Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).
- Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct. Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).
- Breslin, J. W., et al. Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread. Cell. 150, 1235-1248 (2012).
- Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens. Immunity. 42, 172-185 (2015).
- Moussion, C., Girard, J. P. Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules. Nature. 479, 542-546 (2011).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).
- Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone. Immunology. 71, 423-427 (1990).
- Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression. Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).
- Mebius, R. E., et al. Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow. Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).
- Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis. Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).
- Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment. Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).
- Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice. Journal of Biological Methods. 1, 6 (2014).
- Lin, Y., et al. Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route. Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).
- Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095 (2016).
