Bloqueando o fluxo linfático suturing afferent vasos linfáticos em camundongos
Summary
Um protocolo para bloquear o fluxo linfático por sutura cirúrgica de vasos linfáticos diferentes é apresentado.
Abstract
Os vasos linfáticos são fundamentais na manutenção do equilíbrio dos fluidos teciduais e na otimização da proteção imunológica, transportando antígenos, citocinas e células para drenar linfonodos (LNs). A interrupção do fluxo linfático é um método importante ao estudar a função dos vasos linfáticos. Os diferentes vasos linfáticos do footpad murine aos linfonodos popliteis (pLNs) são bem definidos como as únicas rotas para drenagem linfática para as pLNs. Suturar esses vasos linfáticos diferentes pode impedir seletivamente o fluxo linfático para as PLNs. Este método permite a interferência no fluxo linfático com danos mínimos às células linfáticas do endotelial linfático no pLN drenante, os vasos linfáticos aferentes, bem como outros vasos linfáticos ao redor da área. Este método tem sido usado para estudar como a linfática impacta as venules endoteliais altas (HEV) e a expressão da quimioterapia na LN, e como o linfático flui através do tecido adiposo ao redor da LN na ausência de vasos linfáticos funcionais. Com o reconhecimento crescente da importância da função linfática, este método terá aplicações mais amplas para desvendar ainda mais a função dos vasos linfáticos na regulação do microambiente LN e respostas imunológicas.
Introduction
A organização espacial do sistema linfático fornece suporte estrutural e funcional para remover eficientemente o fluido extracelular e transportar antígenos e células que apresentam antígenos (APCs) para as LNs drenantes. Os vasos linfáticos iniciais (também chamados de capilares linfáticos) são altamente permeáveis devido às suas junções intercelulares descontínuas, que facilitam a coleta efetiva de fluidos, células e outros materiais dos espaços extracelulares circundantes1. Os vasos linfáticos iniciais se fundem na coleta de vasos linfáticos, que possuem junções intercelulares apertadas, uma membrana contínua do porão e cobertura muscular linfática. Os vasos linfáticos de coleta são responsáveis pelo transporte de linfáticos coletados para as LNs drenantes e, eventualmente, o retorno da linfática à circulação2,3. Os vasos linfáticos coletores que impulsionam linfáticos para a LN drenante são os vasos linfáticos diferentes4,5,6,7. A obstrução de vasos linfáticos diferentes pode bloquear o fluxo linfático para as LNs, que é uma técnica útil ao estudar a função do fluxo linfático.
Estudos anteriores mostraram que o fluxo linfático desempenha um papel significativo no transporte de antígenos e APCs, bem como na manutenção da homeostase da LN. É bem compreendido que os APCs derivados do tecido, tipicamente ativados células dendríticas migratórias (DCs), viajam através dos vasos linfáticos a diferentes para a LN para ativar as células T8. A ideia de que antígenos de forma livre, como micróbios ou antígenos solúveis, fluem passivamente com linfáticos para a LN para ativar APCs residentes em LN vem ganhando aceitação na última década9,10,11,12. Antígenos de forma livre que viajam com linfático levam minutos após a infecção para viajar para a LN, e a ativação celular residente em LN pode ocorrer dentro de 20 minutos após a estimulação. Isso é muito mais rápido do que a ativação de DCs migratórios, que leva mais de 8h para entrar na drenagem LN9. Além de transportar antígenos para iniciar a proteção imunológica, o linfo também transporta citocinas e DCs para a LN para manter seu microambiente, e para suportar a homeostase das células imunes13,14. Anteriormente, o bloqueio do fluxo linfático suturando os diferentes vasos linfáticos demonstrou que a linfática é necessária para manter o fenótipo HEV necessário para suportar a célula T homeostática e a célula B para a LN15,16,17. CCL21 é uma quimiocina crítica que direciona o posicionamento de células DC e T na LN8,18. O bloqueio do fluxo linfático interrompe a expressão CCL21 na LN e potencialmente interrompe o posicionamento da célula DC e T e/ou a interação na LN19. Assim, o bloqueio do fluxo linfático pode revogar direta ou indiretamente o acesso de antígeno/DC à LN drenante, interrompendo o microambiente LN que regula as respostas imunes na LN. Para melhor investigar a função do fluxo linfático, é apresentado um protocolo experimental(Figura 1) para bloquear o fluxo linfático em camundongos, suturando os vasos linfáticos a diferentes do bloco de pé para o pLN. Este método pode ser uma técnica importante para estudos futuros sobre a função linfática em condições saudáveis e doentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
O bloqueio do fluxo linfático terá amplas aplicações na manipulação do fornecimento de antígenos ao LN em condições saudáveis e doentes. É possível usar este método para controlar o tempo de entrega de antígenos, a fim de estudar como o fluxo linfático contínuo regula a resposta imune na drenagem de LNs. Este método de interrupção do fluxo linfático também pode ser usado para estudar como a linfática impacta a compartimentação celular, ativação celular, migração celular e interações célula-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Ava Zardynezhad pela revisão do manuscrito. Este trabalho é apoiado pelo Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR, PJT-156035), e pela Fundação Canadense de Inovação para AFIN (32930), e pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China para Yujia Lin (81901576).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
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