Blocco del flusso linfatico mediante la sutura di vasi linfatici afferenti nei topi
Summary
Viene presentato un protocollo per bloccare il flusso linfatico mediante sutura chirurgica di vasi linfatici afferenti.
Abstract
I vasi linfatici sono fondamentali per mantenere l’equilibrio dei fluidi tissutali e ottimizzare la protezione immunitaria trasportando antigeni, citochine e cellule ai linfonodi drenante (LN). L’interruzione del flusso linfatico è un metodo importante quando si studia la funzione dei vasi linfatici. I vasi linfatici afferenti dal pedana murina ai linfonodi poplitei (PLN) sono ben definiti come le uniche vie per il drenaggio linfatico nei PLN. Suturare questi vasi linfatici afferenti può prevenire selettivamente il flusso linfatico verso i PLAN. Questo metodo consente l’interferenza nel flusso linfatico con danni minimi alle cellule endoteliali linfatiche nel pLN drenante, nei vasi linfatici afferenti e in altri vasi linfatici intorno all’area. Questo metodo è stato utilizzato per studiare come la linfa influisce sulle alte venule endoteliali (HEV) e sull’espressione della chemiochina nella LN e su come la linfa fluisce attraverso il tessuto adiposo che circonda la LN in assenza di vasi linfatici funzionali. Con il crescente riconoscimento dell’importanza della funzione linfatica, questo metodo avrà applicazioni più ampie per svelare ulteriormente la funzione dei vasi linfatici nella regolazione del microambiente LN e delle risposte immunitarie.
Introduction
L’organizzazione spaziale del sistema linfatico fornisce supporto strutturale e funzionale per rimuovere in modo efficiente il fluido extracellulare e trasportare antigeni e cellule che presentano antigeni (APC) nelle LN drenante. I vasi linfatici iniziali (chiamati anche capillari linfatici) sono altamente permeabili a causa delle loro giunzioni intercellulari discontinue, che facilitano l’efficace raccolta di fluidi, cellule e altri materiali dagli spazi extracellularicircostanti 1. I vasi linfatici iniziali si fondono nella raccolta di vasi linfatici, che hanno strette giunzioni intercellulari, una membrana basale continua e una copertura muscolare linfatica. La raccolta dei vasi linfatici è responsabile del trasporto della linfa raccolta nelle LN drenante e, infine, del ritorno della linfa allacircolazione 2,3. I vasi linfatici di raccolta che spingono la linfa nella LN drenante sono i vasi linfatici afferenti4,5,6,7. L’ostruzione dei vasi linfatici afferenti può bloccare il flusso linfatico nelle LN, che è una tecnica utile quando si studia la funzione del flusso linfatico.
Studi precedenti hanno dimostrato che il flusso linfatico svolge un ruolo significativo nel trasporto di antigeni e APC, oltre a mantenere l’omeostasi LN. È ben noto che le APC derivate dai tessuti, tipicamente attivate dalle cellule dendritiche migratorie (IC), viaggiano attraverso i vasi linfatici afferenti fino alla LN per attivare le cellule T8. L’idea che gli antigeni in forma libera, come microbi o antigeni solubili, fluiranno passivamente con la linfa verso l’LN per attivare gli APC residenti in LN ha ottenuto l’accettazione nell’ultimo decennio9,10,11,12. Gli antigeni in forma libera che viaggiano con la linfa prendono minuti dopo l’infezione per viaggiare verso l’LN e l’attivazione cellulare residente in LN può verificarsi entro 20 minuti dopo la stimolazione. Questo è molto più veloce dell’attivazione dei PC di migrazione, che richiede più di 8 ore per entrare nell’LN9 drenante. Oltre a trasportare antigeni per avviare la protezione immunitaria, la linfa trasporta anche citochine e TC nella LN per mantenere il suo microambiente e sostenere l’omeostasi delle celluleimmunitarie 13,14. In precedenza, il blocco del flusso linfatico suturando i vasi linfatici afferenti ha dimostrato che la linfa è necessaria per mantenere il fenotipo HEV necessario per sostenere la cellula T omeostatica e l’homing cellulare B all’LN15,16,17. CCL21 è una chemiochina critica che dirige il posizionamento delle celle DC e T nell’LN8,18. Il blocco del flusso linfatico interrompe l’espressione CCL21 nell’LN e potenzialmente interrompe il posizionamento e/o l’interazione delle cellule DC e T nell’LN19. Pertanto, il blocco del flusso linfatico può abrogare direttamente o indirettamente l’accesso all’antigene /DC all’LN drenante interrompendo il microambiente LN che regola le risposte immunitarie nella LN. Per studiare meglio la funzione del flusso linfatico, viene presentato un protocollo sperimentale (figura 1) per bloccare il flusso linfatico nei topi suturando i vasi linfatici afferenti dal pLN al pLN. Questo metodo può essere una tecnica importante per futuri studi sulla funzione linfatica in condizioni sane e masticate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il blocco del flusso linfatico avrà ampie applicazioni nella manipolazione della somministrazione di antigeni alla LN in condizioni sane e mase. È possibile utilizzare questo metodo per controllare i tempi di erogazione dell’antigene al fine di studiare come il flusso linfatico continuo regola la risposta immunitaria nelle LN drenante. Questo metodo di interruzione del flusso linfatico può anche essere utilizzato per studiare come la linfa influisce sulla compartimentazione cellulare, l’attivazione cellulare, la migra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Ava Zardynezhad per la correzione del manoscritto. Questo lavoro è supportato dal Canadian Institute of Health Research (CIHR, PJT-156035) e dalla Canada Foundation for Innovation for SL (32930), e dalla National Natural Science Foundation of China per Yujia Lin (81901576).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
References
- Pflicke, H., Sixt, M. Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).
- Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).
- Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle. Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).
- Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph. The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).
- Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels. Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).
- Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct. Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).
- Breslin, J. W., et al. Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread. Cell. 150, 1235-1248 (2012).
- Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens. Immunity. 42, 172-185 (2015).
- Moussion, C., Girard, J. P. Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules. Nature. 479, 542-546 (2011).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).
- Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone. Immunology. 71, 423-427 (1990).
- Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression. Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).
- Mebius, R. E., et al. Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow. Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).
- Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis. Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).
- Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment. Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).
- Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice. Journal of Biological Methods. 1, 6 (2014).
- Lin, Y., et al. Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route. Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).
- Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095 (2016).
