Farelerde Afferent Lenfatik Damarlar Dikerek Lenf Akışını Engelleme
Summary
Afferent lenfatik damarların cerrahi dikiş ile lenf akışını engellemek için bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
Lenfatik damarlar doku sıvıdengesini korumak ve antijenler, sitokinler ve hücreleri drenaj lenf düğümleri (LNs) taşıyarak bağışıklık koruma optimize kritik öneme vardır. Lenf akıtıcıdamarların işlevini incelerken lenf akışının kesilmesi önemli bir yöntemdir. Murine footpad popliteal lenf düğümleri için afferent lenf damarları (pLNs) iyi pLNs içine lenf drenaj için tek yol olarak tanımlanır. Bu afferent lenfatik damarları niçin seçici olarak pLN’lere lenf akışını önleyebilir. Bu yöntem drenaj pLN lenfatik endotel hücrelerine minimal hasar ile lenf akışında girişim sağlar, afferent lenfatik damarlar, yanı sıra alan etrafında diğer lenfatik damarlar. Bu yöntem lenf etkileri yüksek endotel venülleri nasıl çalışma için kullanılmıştır (HEV) ve LN kemokin ekspresyonu, ve nasıl lenf fonksiyonel lenfatik damarların yokluğunda LN çevreleyen yağ dokusu ile akar. Lenfatik fonksiyonun öneminin giderek daha fazla tanınması ile, Bu yöntem ln mikroçevre ve bağışıklık yanıtları düzenleyen lenfatik damarların işlevini daha da çözmek için daha geniş uygulamalar alacaktır.
Introduction
Lenfatik sistemin mekansal organizasyonu, hücre dışı sıvıyı verimli bir şekilde çıkarmak ve antijenleri ve antijen sunan hücreleri (AAP’ler) drenaj lı LN’lere verimli bir şekilde çıkarmak için yapısal ve fonksiyonel destek sağlar. İlk lenfatik damarlar (lenfatik kılcal damarlar olarak da adlandırılır) sıvıların, hücrelerin ve diğer malzemelerin çevredeki hücre dışı alanlardan etkili bir şekilde toplanmasını kolaylaştıran kesintisiz hücreler arası kavşakları nedeniyle son derece geçirbilebilirdir1. İlk lenfatik damarlar sıkı hücreler arası kavşaklar, sürekli bir bazal membran ve lenfatik kas kapsama sahip lenfatik damarları toplama içine birleştirmek. Lenfatik damarların toplanması, toplanan lenflerin drenaj LN’lerine taşınmasından ve sonunda lenflerin dolaşıma geri dönmesinden sorumludur2,3. Drenaj LN içine lenf itmek toplama lenf damarları afferent lenfatik damarlar4,5,6,7. Afferent lenfatik damarların tıkanıklığı LNs içine lenf akışını engelleyebilir, hangi lenf akışının işlevini incelerken yararlı bir tekniktir.
Önceki çalışmalar lenf akımı antijenler ve AAP’ler taşıma önemli bir rol oynadığını göstermiştir, yanı sıra LN homeostazı korumak. Doku kaynaklı AKO’ların, tipik olarak aktif olarak göç eden dendritik hücreler (DCs) ile T hücrelerini aktive etmek için LN’ye giden varlıklı lenfatik damarların t hücreleri8. Fikir serbest form antijenler, mikroplar veya çözünür antijenler gibi, ln yerleşik AAP’leri etkinleştirmek için LN lenf ile pasif akışsonon yıl içinde kabul kazanıyor olmuştur 9,10,11,12. Lenf ile seyahat serbest form antijenler LN seyahat enfeksiyon dan sonra dakika sürer, ve LN-yerleşik hücre aktivasyonu 20 dakika içinde stimülasyon oluşabilir. Bu çok göç DC’lerin aktivasyonu daha hızlıdır, hangi drenaj LN girmek için 8 saatten fazla sürer9. Bağışıklık koruma başlatmak için antijenler taşıma yanı sıra, lenf de mikroortamını korumak için LN sitokinler ve DCs taşır, ve bağışıklık hücresi homeostaz desteklemek için13,14. Daha önce, afferent lenfatik damarları dikerek lenf akışını engelleme lenfln 15, 16,17homeostatik T hücre ve B hücre homing desteklemek için gerekli HEV fenotip korumak için gerekli olduğunu gösterdi . CCL21LNDC ve T hücre konumlandırma yönlendirir kritik bir kemokin 8,18. Lenf akışının engellenmesi LN’deki CCL21 ekspresyonunu kesintiye uğratur ve LN19’dakiDC ve T hücre konumlandırmasını ve/veya etkileşimini potansiyel olarak kesintiye uğratur. Böylece, lenf akışını niçin bloke etmek, LN’deki bağışıklık yanıtlarını düzenleyen LN mikroortamını bozarak antijen/DC’nin drenaj LN’ye erişimini doğrudan veya dolaylı olarak engelleyebilir. Lenf akışının işlevini daha iyi araştırmak için, pediyeden pLN’ye kadar olan afferent lenfatik damarları dikerek farelerdeki lenf akışını engellemek için deneysel bir protokol(Şekil 1)sunulur. Bu yöntem sağlıklı ve hastalıklı koşullarda lenfatik fonksiyon üzerinde gelecekteki çalışmalar için önemli bir teknik olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lenf akışını niçin bloke etmek, sağlıklı ve hastalıklı koşullarda LN’ye antijen teslimatını manipüle etmede geniş uygulamalara sahip olacaktır. Sürekli lenf akışının NN’lerin boşaltIlmesinde bağışıklık yanıtını nasıl düzenlediğini incelemek için antijen doğumunun zamanlamasını kontrol etmek için bu yöntemi kullanmak mümkündür. Lenf akışı kesinti Bu yöntem de lenf etkileri hücre komedizasyonu, hücre aktivasyonu, hücre göçü ve LN hücre hücre etkileşimleri nasıl çalı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar ava Zardynezhad’a el yazmasının okunması için teşekkür ediyor. Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüsü (CIHR, PJT-156035) ve Kanada Yenilik Vakfı SL (32930) ve Yujia Lin için Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81901576) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
References
- Pflicke, H., Sixt, M. Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).
- Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).
- Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle. Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).
- Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph. The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).
- Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels. Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).
- Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct. Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).
- Breslin, J. W., et al. Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread. Cell. 150, 1235-1248 (2012).
- Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens. Immunity. 42, 172-185 (2015).
- Moussion, C., Girard, J. P. Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules. Nature. 479, 542-546 (2011).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).
- Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone. Immunology. 71, 423-427 (1990).
- Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression. Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).
- Mebius, R. E., et al. Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow. Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).
- Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis. Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).
- Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment. Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).
- Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice. Journal of Biological Methods. 1, 6 (2014).
- Lin, Y., et al. Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route. Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).
- Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095 (2016).
