Блокирование лимфатического потока путем засовывания афферентных лимфатических сосудов у мышей
Summary
Представлен протокол блокирования лимфатического потока хирургическим завозом афферентных лимфатических сосудов.
Abstract
Лимфатические сосуды имеют решающее значение для поддержания баланса тканевой жидкости и оптимизации иммунной защиты путем транспортировки антигенов, цитокинов и клеток для слива лимфатических узлов (LNs). Прерывание лимфатического потока является важным методом при изучении функции лимфатических сосудов. Афферентные лимфатические сосуды от муринной подножки до поплитальных лимфатических узлов (pLNs) четко определены как единственные маршруты для лимфатического дренажа в pLNs. Засасывания этих афферентных лимфатических сосудов может избирательно предотвратить лимфатический поток в PLNs. Этот метод позволяет помехи в лимфатическом потоке с минимальным ущербом для лимфатических эндотелиальных клеток в дренажных ЛЬН, афферентных лимфатических сосудов, а также других лимфатических сосудов вокруг области. Этот метод был использован для изучения того, как лимфатические воздействия высоких эндотелиальных вен (HEV) и хемокин выражение в ЛН, и как лимфатические потоки через жировой ткани, окружающие ЛН в отсутствие функциональных лимфатических сосудов. С растущим признанием важности лимфатической функции, этот метод будет иметь более широкое применение для дальнейшего распутывания функции лимфатических сосудов в регулировании микроокноронности LN и иммунных реакций.
Introduction
Пространственная организация лимфатической системы обеспечивает структурную и функциональную поддержку для эффективного удаления внеклеточной жидкости и транспортировки антигенов и антигеносующих клеток (БТР) в дренажные LNs. Первоначальные лимфатические сосуды (также называемые лимфатическими капиллярами) очень проницаемы из-за их прерывистых межклеточных соединений, которые облегчают эффективный сбор жидкостей, клеток и других материалов из окружающих внеклеточныхпространств 1. Первоначальные лимфатические сосуды сливаются в сбор лимфатических сосудов, которые имеют жесткие межклеточные соединения, непрерывную мембрану подвала, и лимфатического покрытия мышц. Сбор лимфатических сосудов несут ответственность за транспортировку собранных лимфатических в дренажных LNs и в конечном итоге возвращение лимфыв кровообращение 2,3. Собирающ лимфатические сосуды которые двигают лимфу в стекая LN будут afferent лимфатическими сосудами4,5,6,7. Препятствие афферентных лимфатических сосудов может блокировать поток лимфы в ЛП, что является полезным методом при изучении функции лимфатического потока.
Предыдущие исследования показали, что лимфатический поток играет значительную роль в транспортировке антигенов и БТР, а также поддержания ЛН гомеостаза. Хорошо известно, что ткани полученных БТР, как правило, активированных мигрирующих дендритных клеток (DCs), путешествия через афферентные лимфатические сосуды в ЛН, чтобы активироватьТ-клетки 8. Идея о том, что антигены свободной формы, такие как микробы или растворимые антигены, пассивно текут с лимфой в ЛН для активации БТР-резидентов ЛН, набираетпризнание в последнее десятилетие 9,10,11,12. Свободной формы антигенов путешествия с лимфой занять несколько минут после заражения, чтобы поехать в ЛН, и LN-резидентов активации клеток может произойти в течение 20 минут после стимуляции. Это гораздо быстрее, чем активация мигрирующих DCs, которая занимает более 8 ч, чтобы войти в дренаж LN9. Помимо транспортировки антигенов для инициирования иммунной защиты, лимфа также несет цитокины и ДК в ЛН для поддержания его микроокнижения, а также для поддержки гомеостазаиммунных клеток 13,14. Ранее, блокирование лимфатического потока, зашивая афферентных лимфатических сосудовпоказали,что лимфатические требуется для поддержания фенотипа HEV, необходимых для поддержки гомеостатической Т-клеток и B-клеток самонаведения в LN15,16,17. CCL21 является критическим хемокин, который направляет DC и Т-клеток позиционирования в LN8,18. Блокирование лимфатического потока прерывает выражение CCL21 в LN и потенциально прерывает позиционирование DC и Т-клеток и/или взаимодействие в LN19. Таким образом, блокирование лимфатического потока может прямо или косвенно отогреть антиген / DC доступ к дренажной ЛН, нарушая микроокноронику LN, которая регулирует иммунные реакции в ЛН. Чтобы лучше исследовать функцию лимфатического потока, представлен экспериментальный протокол(рисунок 1), чтобы блокировать лимфатический поток у мышей, засовывав афферентные лимфатические сосуды от подножки до pLN. Этот метод может быть важным методом для будущих исследований по лимфатической функции в здоровых и больных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Блокирование лимфатического потока будет иметь широкое применение в манипулировании доставкой антигена в ЛН в здоровых и больных условиях. Можно использовать этот метод для контроля сроков доставки антигена для того, чтобы изучить, как непрерывный поток лимфы регулирует иммунный отв…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Аву Зардынежад за корректорирование рукописи. Эта работа поддерживается Канадским институтом исследований в области здравоохранения (CIHR, PJT-156035) и Канадским фондом инноваций для SL (32930), а также Национальным фондом естественных наук Китая для Yujia Lin (81901576).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
References
- Pflicke, H., Sixt, M. Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).
- Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).
- Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle. Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).
- Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph. The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).
- Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels. Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).
- Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct. Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).
- Breslin, J. W., et al. Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread. Cell. 150, 1235-1248 (2012).
- Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens. Immunity. 42, 172-185 (2015).
- Moussion, C., Girard, J. P. Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules. Nature. 479, 542-546 (2011).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).
- Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone. Immunology. 71, 423-427 (1990).
- Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression. Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).
- Mebius, R. E., et al. Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow. Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).
- Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis. Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).
- Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment. Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).
- Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice. Journal of Biological Methods. 1, 6 (2014).
- Lin, Y., et al. Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route. Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).
- Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095 (2016).
