Einführung von Punktmutationen in humane pluripotente Stammzellen durch nahtlose Genom-Editierung

1. Design und Konstruktion von CRISPR/Cas9n-sgRNA-Expressionsplasmiden Suchen Sie nach 20-bp-Führungssequenzen direkt stromaufwärts eines beliebigen 5′-NGG in der Nähe des zu ändernden Standorts. Ein Paar Single-Guide-RNAs (sgRNAs) wird benötigt, wenn die Cas9-Nickase (Cas9n) aus Streptococcus pyogenes verwendet wird. Das sgRNA-Paar muss in der Lage sein, 5′-Überhänge beim Nicken miteinem Offset von -4 bis 20 bp 6 zu erzeugen. Bestellen Sie notwendige Oligos und pSpCas9n-2A-puro Vektor. Klonen Sie sgRNA in den pSpCas9n-Vektor zur Co-Expression mit Cas9n gemäß dem veröffentlichten Protokoll12. 2. Entwurf und Aufbau eines piggyBac-basierten Targeting-Vektors Laden Sie die Zielgensequenz herunter und suchen Sie nach einer TTAA-Stelle in der Nähe der zu modifizierenden Stelle.HINWEIS: Der Abstand zwischen dem TTAA-Standort und dem zu ändernden Standort sollte so gering wie möglich sein. Wenn innerhalb der kodierenden Sequenz und innerhalb eines 100-bp-Abstands keine TTAA-Stelle vorhanden ist, ist es notwendig, eine durch synonyme Nukleotidsubstitutionen einzuführen. Entwerfen Sie Homologiearme (HAs) und integrieren Sie gewünschte Punktmutationen in die HAs. Die optimale Länge von HAs sollte etwa 500 – 1200 bp betragen.HINWEIS: Es wird empfohlen, synonyme Nukleotidsubstitutionen einzuführen, um die PAM-Sequenz zu mutieren, um eine mögliche Cas9n-Re-Spaltung zu vermeiden. Konstruieren Sie den endgültigen Zielvektor nach einem festgelegten Protokoll10.HINWEIS: In dem hier verwendeten Zielvektor wird eine PGK-Promotor-gesteuerte Puro-deltaTK-Auswahlkassette von transposon-invertierten Wiederholungen flankiert. 3. Genetische Editierung humaner pluripotenter Stammzellen Halten Sie humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 auf rekombinanten Laminin 521-beschichteten Oberflächen (5 μg/ml) in mTeSR1-Medium13. Die Zellen sollten nach 72 Stunden nach einem 1:3-Split-Verhältnis 70-85% Konfluenz erreichen.HINWEIS: Falls vorhanden, entfernen Sie spontan differenzierte Zellen vor dem täglichen Medienwechsel, indem Sie sie sanft absaugen. Am Tag der Transfektion genügend Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit 300 μL der Laminin 521-Lösung (5 μg/ml) bei 37 °C für mindestens 2 h beschichten. Entfernen Sie die Beschichtungslösung vorsichtig und geben Sie 300 μL frisches mTeSR1-Medium, ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor, in jede Vertiefung und legen Sie dann die Platte zurück in den Inkubator, um Zellen aufzunehmen.HINWEIS: Lassen Sie die Platten zu keinem Zeitpunkt trocknen, wenn die Laminin-Beschichtungslösung entfernt wird. Ziehen Sie die hPS-Zellen aus dem Inkubator, entfernen Sie verbrauchtes Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit 1 ml sterilem 1x DPBS. Geben Sie 1 ml sanftes Zelldissoziationsreagenz in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte und inkubieren Sie bei 37 °C für 6-8 min, um die Zellen zu dissoziieren.HINWEIS: Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte und prüfen Sie, ob sich die Zellen leicht lösen können, um zu entscheiden, ob die Verdauung lang genug ist. Pipettieren Sie vorsichtig mit einer P1000-Spitze, um alle hPSCs abzuheben. Beenden Sie die Dissoziation durch Zugabe von 2 ml frischem mTeSR1-Medium, ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor (Y-27632), in die Zellsuspension. Gut mischen und die einzellige Suspension in ein 50-ml-Röhrchen geben und bei 200 x g für 3 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen gut in 2 ml frischem mTeSR1-Medium, ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer. Verwenden Sie Trypan Blue, um tote Zellen zu färben und auszuschließen. 8 x 10 5 bis 1 x 106 lebende Zellen werden für jede Nukleofektionsreaktion in ein1,5 ml Röhrchen überführt und bei 200 x g für 3 min zentrifugiert. Dann saugen Sie den Überstand vorsichtig ab. Mischen Sie 3 μg der gepaarten Cas9n-sgRNA-Expressionsplasmide und 5 μg Zielvektorplasmid in 100 μL gemischter Nukleofektionslösung/Ergänzung aus dem humanen Stammzell-Nukleofektionskit. Verwenden Sie das GFP-Kontrollplasmid aus dem Kit und bereiten Sie auch eine GFP-Kontrollplasmidmischung vor.HINWEIS: Es ist wichtig, eine Maxi-Vorbereitung aller Plasmide durchzuführen, um die Endotoxinkontamination vor der Nukleofektion zu reduzieren. Die Konzentration der Plasmide sollte etwa 1 μg/μL betragen. Verwenden Sie die DNA-Mischung (Volumen ~ 111 μL), um die vorbereiteten Zellen zu resuspendieren und in eine Elektroporationsküvette (im Lieferumfang des Nukleofektionskits enthalten) zu übertragen, um Blasen zu vermeiden. Elektropolieren Sie die Zellen mit der Nukleofektionsvorrichtung, indem Sie die optimierten Bedingungen für menschliche pluripotente Stammzellen auswählen.HINWEIS: Wenn Sie das Nukleofektionskit zum ersten Mal für humane pluripotente Stammzellen verwenden, ist es notwendig, das Elektroporationsprogramm zu testen und das effizienteste auszuwählen. Sofort 500 μL frisches und warmes bis 37 °C mTeSR1-Medium, ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor, in die elektropolierten Zellen geben. Die Mischung wird in 2 Vertiefungen einer aus den Schritten 3.2 und 3.3 vorbereiteten 24-Well-Platte überführt. Legen Sie die Platte schnell wieder in den 37 °C/5%CO2-Inkubator und lassen Sie die Zellen sich erholen. 12-16 h später das Zellerhaltungsmedium wechseln. Wenn die Zellen Zell-Zell-Kontakt hergestellt haben, ziehen Sie den ROCK-Inhibitor zurück, wenn nicht, ergänzen Sie das Medium weiterhin mit dem Inhibitor. Überprüfen Sie zwischen 24-48 h die Effizienz der Nukleofektion, indem Sie die GFP-Expression in den Kontrollzellen untersuchen. GFP-positive Zellen sollten mindestens 30 Prozent betragen. 48 h nach der Nukleofektion beginnen Sie mit der Zellselektion, indem Sie das mTeSR1-Medium mit 1 μg/ml Puromycin ergänzen. 72 h nach der Nukleofektion das mTeSR1-Medium mit 0,5 μg/ml Puromycin ergänzen. Wenn die Zellkonfluenz niedriger als 30% ist, ergänzen Sie das Medium auch mit einem 10 μM ROCK-Inhibitor. 4-6 Tage nach der Nukleofektion passieren Sie die Puromycin-resistenten Zellen zu 10-15 x 96-Well-Platten mit einer Konzentration von 0,8 Zellen / Well.HINWEIS: Es ist wichtig, das Medium mit 10 μM ROCK-Inhibitor und 0,5 μg / ml Puromycin zu ergänzen. Halten Sie diese Zellen 10-12 Tage lang bei 37 °C / 10% CO2 , um einzelne Zellkolonien zu bilden. Medium einmal 7 Tage nach der Aussaat auffüllen.HINWEIS: Ein erhöhter CO2 -Gehalt hilft einzelnen hPSCs, Kolonien zu bilden. Markieren Sie Vertiefungen, die eine einzelne Kolonie enthalten, und ersetzen Sie das Medium durch frisches mTeSR1-Medium, das 0,5 μg/ml Puromycin, aber keinen ROCK-Inhibitor enthält.HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt werden die Zellen unter 37 °C/5%CO2 gezüchtet. Zwei Tage später wechseln Sie das Medium für Brunnen mit undifferenzierten Kolonien. Ergänzen Sie das Medium mit 10 μM ROCK-Inhibitor und 0,5 μg/ml Puromycin.HINWEIS: In einigen Vertiefungen haben sich die Zellen möglicherweise differenziert und müssen verworfen werden. Verwenden Sie P2-Pipettenspitzen, um die Kolonien sanft abzukratzen. Übertragen Sie die von einer Kolonie abgeleitete Zellsuspension in 2 neue Vertiefungen auf separaten 96-Well-Platten und verwenden Sie eine für die Genotypisierung und eine für die Wartung.HINWEIS: Es ist wichtig, die Kolonien sorgfältig zu pflegen und das spontane Differenzierungsniveau auf ein Minimum zu beschränken. Nehmen Sie die Platte mit Zellen zur Genotypisierung heraus, sobald der Konfluenz in den meisten Vertiefungen 50% oder mehr erreicht hat. Entsorgen Sie das verbrauchte Medium und waschen Sie die Zellen dann einmal mit DPBS. Lysieren Sie die Zellen mit Bradley-Lysepuffer gut und isolieren Sie genomische DNA aus jeder Vertiefung in der Platte nach zugehörigem Protokoll (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate). Verwenden Sie eine Drei-Primer-Junction-PCR-Methode, um sowohl linke als auch rechte Homologiearme unabhängig voneinander zu genotypisieren10.HINWEIS: Ein Schema, das die PCR-Methode zeigt, ist in Abbildung 2 dargestellt. Senden Sie die Junction-PCR-Produkte für beide Homologiearme von 4-5 Kolonien zur Sanger-Sequenzierung und erhalten Sie die Sequenzen.HINWEIS: Das Sequenzierungsergebnis von 2 etablierten Kolonien ist in Abbildung 3A dargestellt. Halten Sie Kolonien mit dem richtigen Genotyp und werfen Sie den Rest weg. Erweitern Sie die richtigen Kolonien unter kontinuierlicher Puromyklektion und frieren Sie sie so früh wie möglich ein. 4. Entfernung von Transposon aus gezielten humanen pluripotenten Stammzellen Pflegen Sie eine Kolonie mit korrektem Genotyp unter 0,5 μg / ml Puromycin-Selektion. Nucleofect 8 x 10 5 bis 1 x 106 Zellen mit5 μg hyperaktiver Transposase (pCMV-hyPBase) wie oben beschrieben (Abschnitt 3, Schritte 3.4-3.18). Führen Sie parallel eine GFP-Kontrollnukleofektion durch.HINWEIS: Puromycin sollte unmittelbar nach der Nukleofektion dieser Zellen aus dem mTeSR1-Medium entfernt werden. Züchten und Screening auf Zellen, wobei die Puro-deltaTK-Auswahlkassette nach veröffentlichten Verfahren entfernt wurde10.HINWEIS: Es ist wichtig, die ursprünglichen Verfahren sorgfältig zu befolgen. FIAU, oder 1-(2-Desoxy-2-fluor-β-d-arabinofuranosyl)-5-iodouracil), wurde als Thymidin-Analogon für Herpes-simplex-Virus-abgeleitete Thymidinkinase (HSV-tk)-basierte negative Selektion verwendet. Sequenzieren Sie den modifizierten Bereich, um die Entfernung des Transposon zu bestätigen.HINWEIS: Das Sequenzierungsergebnis von 3 etablierten Kolonien ist in Abbildung 3B dargestellt. Halten Sie Kolonien mit dem richtigen Genotyp und erweitern Sie sie für die weitere Verwendung. Führen Sie eine Charakterisierung von Pluripotenzmarkern in den ausgewählten Kolonien durch, bevor Sie sie für die weitere Analyse verwenden.HINWEIS: Die Charakterisierung von zwei etablierten Kolonien ist in Abbildung 4 dargestellt.