シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入

1. CRISPR/Cas9n-sgRNA発現プラスミドの設計と構築 改変部位付近の5′-NGGのすぐ上流にある20 bpのガイド配列を検索します。 化膿レンサ 球菌由来のCas9ニッカーゼ(Cas9n)を使用する場合は、一対のシングルガイドRNA(sgRNA)が必要です。sgRNAのペアは、-4〜20 bpのオフセット6でニッキング時に5’のオーバーハングを生成できなければなりません。 必要なオリゴとpSpCas9n-2A-プロベクターを注文します。 sgRNAをpSpCas9nベクターにクローニングして、公開されたプロトコル12に従ってCas9nと共発現させる。 2. piggyBacベースのターゲティングベクターの設計と構築 標的遺伝子配列をダウンロードし、改変部位付近のTTAA部位を検索する。注: TTAA サイトと変更予定サイトの間の距離は、できるだけ短くする必要があります。コード配列内で、100-bp以内にTTAA部位が存在しない場合は、同義ヌクレオチド置換を行って導入する必要がある。 ホモロジーアーム(HA)を設計し、HAに目的の点変異を組み込みます。HA の最適な長さは、約 500 〜 1200 bp である必要があります。注:Cas9nの再切断の可能性を回避するために、PAM配列を変異させるために同義のヌクレオチド置換を導入することをお勧めします。 確立されたプロトコル10に従って最終的なターゲティングベクトルを構築する。注:ここで使用されるターゲティングベクターでは、PGKプロモーター駆動のpuro-deltaTK選択カセットがトランスポゾン反転リピートによって隣接されています。 3. ヒト多能性幹細胞の遺伝子編集 ヒト多能性幹細胞(hPSC)を加湿インキュベーター内で37°C、組換えラミニン521コーティング表面(5 μg/mL)の5%CO2 をmTeSR1培地13に維持します。細胞は、1:3の分割比の後、72時間後に70〜85%のコンフルエントに達するはずです。注:存在する場合は、毎日の培地交換の前に、自然に分化した細胞を穏やかに吸引して取り除きます。 トランスフェクション当日、24 ウェルプレートのウェルに 300 μL のラミニン 521 溶液 (5 μg/mL) を 37 °C で 2 時間以上コーティングします。 コーティング溶液を穏やかに除去し、10 μM ROCK阻害剤を添加した300 μLの新鮮なmTeSR1培地を各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻して細胞を受け取ります。注意: ラミニンコーティング溶液を除去するときは、プレートを乾燥させないでください。 ストックhPSCをインキュベーターから移動し、使用済み培地を除去してから、1 mLの滅菌1x DPBSを使用して細胞を1回洗浄します。 穏やかな細胞解離試薬1 mLを6ウェルプレートの各ウェルに加え、37°Cで6〜8分間インキュベートして細胞を解離させます。注意: プレートを軽くたたき、細胞が簡単に剥がれるかどうかを確認して、消化が十分に長いかどうかを判断します。 P1000チップを使用してゆっくりと上下にピペットで動かし、すべてのhPSCを持ち上げます。 10 μM ROCK阻害剤(Y-27632)を添加した2 mLの新鮮なmTeSR1培地を細胞懸濁液に加えて解離を終了します。 よく混合し、単一細胞懸濁液を50 mLチューブに移し、室温で200 x g で3分間遠心分離します。 上清を除去し、10 μM ROCK阻害剤を添加した2 mLの新鮮なmTeSR1培地に細胞をよく再懸濁します。 血球計算盤を使用して生細胞をカウントします。トリパンブルーを使用して、死んだ細胞を染色して除外します。 8 x 10 5から1 x 106生細胞を各ヌクレオフェクション反応のために1.5 mLチューブに移し、200 x gで3分間遠心分離します。その後、上清を注意深く吸引します。 3 μgのペアCas9n-sgRNA発現プラスミドと5 μgのターゲティングベクタープラスミドを、ヒト幹細胞核効果キットの100 μLの混合ヌクレオフェクション溶液/サプリメントに混合します。キットのGFPコントロールプラスミドを使用し、GFPコントロールプラスミドミックスも調製します。注:核代謝前のエンドトキシン汚染を減らすために、すべてのプラスミドのマキシプレップを行うことが重要です。プラスミドの濃度は約1 μg/μLである必要があります。 DNAミックス(容量~111 μL)を使用して、調製した細胞を再懸濁し、気泡を避けてエレクトロポレーションキュベット(ヌクレオフェクションキットに付属)に移します。 ヒト多能性幹細胞に最適化された条件を選択することにより、核オフフェクションデバイスを使用して細胞をエレクトロポレーションします。注:ヒト多能性幹細胞用の核効果キットを初めて使用する場合は、エレクトロポレーションプログラムをテストし、最も効率的なものを選択する必要があります。 10 μM ROCK阻害剤を添加した37°CのmTeSR1培地に、新鮮で温かい500 μLをエレクトロポレーション細胞に直ちに加えます。ステップ3.2および3.3で調製した24ウェルプレートの2ウェルにミックスを移します。 プレートを37°C/5%CO2 インキュベーターにすばやく戻し、細胞を回復させます。 12〜16時間後、細胞維持培地を交換します。細胞が細胞間接触を確立した場合は、ROCK阻害剤を回収し、そうでない場合は、阻害剤を培地に補充し続ける。 24〜48時間の間に、コントロール細胞におけるGFP発現を調べることにより、核オフ化効率を確認する。GFP陽性細胞は少なくとも30%でなければなりません。 ニュークレオフェクションの48時間後、mTeSR1培地に1 μg/mLのピューロマイシンを添加して細胞の選択を開始します。 ヌクレオフェクションの72時間後、mTeSR1培地に0.5 μg/mLのピューロマイシンを補充します。細胞コンフルエントが30%より低い場合は、10 μM ROCK阻害剤も培地に補給します。 ヌクレオフェクション後4〜6日で、ピューロマイシン耐性細胞を0.8細胞/ウェルの濃度で10〜15 x 96ウェルプレートに継代します。注:培地に10 μM ROCK阻害剤と0.5 μg/mLピューロマイシンを補給することが不可欠です。 これらの細胞を37°C/10%CO2で10〜12 日間維持して、単一細胞由来のコロニーを形成します。播種後7日で培地を補充する。注:CO2 レベルの上昇は、私たちの経験から単一のhPSCがコロニーを形成するのに役立ちます。 単一コロニーを含むウェルにマークを付け、培地を0.5 μg/mLのピューロマイシンを含むがROCK阻害剤を含まない新鮮なmTeSR1培地に置き換えます。注:この時点から、細胞は37°C / 5%CO2の下で成長します。 2日後、未分化コロニーを含むウェルの培地を交換した。培地に10 μM ROCK阻害剤と0.5 μg/mLピューロマイシンを補充します。注:一部のウェルでは、細胞が分化している可能性があり、廃棄する必要があります。 P2ピペットチップを使用して、コロニーをやさしくこすり落とします。1つのコロニーに由来する細胞懸濁液を別々の96ウェルプレート上の2つの新しいウェルに移し、1つはジェノタイピングに、もう1つは維持に使用します。注:コロニーを注意深く維持し、自然分化レベルを最小限に抑えることが重要です。 ほとんどのウェルのコンフルエントが50%以上に達したら、ジェノタイピング用の細胞を含むプレートを取り出します。使用済みの培地を捨ててから、DPBSで細胞を一度洗浄します。 Bradley溶解バッファーを使用してウェル内の細胞を溶解し、関連するプロトコルに従ってプレート内の各ウェルからゲノムDNAを分離します(https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate)。 3プライマージャンクションPCR法を用いて、左右両方の相同性アームを独立して遺伝子型決定する10。注:PCR法を示すスキームを 図2に示します。 サンガーシーケンシングのために4〜5コロニーから両方の相同性アームのジャンクションPCR産物を送り、配列を取得します。注:2つの確立されたコロニーの配列決定結果を 図3Aに示します。 正しい遺伝子型のコロニーを保持し、残りを破棄します。 連続的なピューロマイシン選択の下で正しいコロニーを拡大し、可能な限り早い継代でそれらを凍結する。 4. 標的ヒト多能性幹細胞からのトランスポゾン除去 正しい遺伝子型のコロニーを 1 つ 0.5 μg/mL ピューロマイシン選択下に維持します。 上記のように5μgの高活性トランスポザーゼ(pCMV-hyPBase)を有するNucleofect 8 x 105 〜1x 10 6 細胞(セクション3、ステップ3.4〜3.18)。GFP制御の核反応を並行して行います。注:ピューロマイシンは、これらの細胞を核放出した直後にmTeSR1培地から除去する必要があります。 公開された手順に従ってpuro-deltaTK選択カセットを取り外した細胞を増殖させ、スクリーニングします10.注意: 元の手順に注意深く従うことが重要です。FIAU、または1-(2-デオキシ-2-フルオロ-β-D-アラビノフラノシル)-5-ヨードラシル)は、単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ(HSV-tk)ベースのネガティブセレクションのチミジン類似体として使用されました。 修飾領域を配列決定し、トランスポゾンの除去を確認する。注:3つの確立されたコロニーの配列決定結果を 図3Bに示します。 コロニーを正しい遺伝子型で保持し、さらなる使用のために拡張します。 選択したコロニーの多能性マーカーの特性評価を実行してから、さらなる分析に使用します。注:2つの確立されたコロニーの特性評価を 図4に示します。