Введение точечных мутаций в плюрипотентные стволовые клетки человека с помощью бесшовного редактирования генома

1. Проектирование и построение плазмид экспрессии CRISPR/Cas9n-sgRNA Поиск 20-bp направляющих последовательностей непосредственно вверх по течению от любого 5′-NGG рядом с местом, подлежащим изменению. Пара одноповодных РНК (sgRNAs) необходима при использовании Cas9 nickase (Cas9n) из Streptococcus pyogenes . Пара sgRNAs должна быть в состоянии генерировать 5′-дюймовые свесы при проколе со смещением от -4 до 20 bp6. Упорядочить необходимые олиго и вектор pSpCas9n-2A-puro. Клонирование sgRNA в вектор pSpCas9n для совместной экспрессии с Cas9n в соответствии с опубликованным протоколом12. 2. Проектирование и построение вектора таргетинга на основе piggyBac Загрузите целевую последовательность генов и найдите сайт TTAA рядом с сайтом, который будет изменен.ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние между участком TTAA и сайтом, подлежащим изменению, должно быть как можно меньшим. Если в пределах кодирующей последовательности и сайт TTAA не присутствует на расстоянии 100 bp, необходимо ввести его, сделав синонимичные нуклеотидные замены. Разработайте гомологические рукава (HA) и включите желаемые точечные мутации в HA. Оптимальная длина HA должна быть в районе 500 – 1200 bp.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется вводить синонимичные нуклеотидные замены для мутации последовательности PAM, чтобы избежать потенциального повторного расщепления Cas9n. Постройте конечный вектор таргетинга в соответствии с установленным протоколом10.ПРИМЕЧАНИЕ: В векторе таргетинга, используемом здесь, кассета выбора PURO-deltaTK, управляемая промотером PGK, окружена транспозонными инвертированными повторами. 3. Генетическое редактирование плюрипотентных стволовых клеток человека Поддерживать плюрипотентные стволовые клетки человека (hPSCs) в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 на рекомбинантных поверхностях с покрытием ламинин 521 (5 мкг/мл) в среде mTeSR113. Клетки должны достичь 70-85% слияния через 72 часа после соотношения расщепления 1:3.ПРИМЕЧАНИЕ: Если они присутствуют, удалите спонтанно дифференцированные клетки перед ежедневным изменением среды, осторожно аспирируя их. В день трансфекции покрывают достаточное количество лунок 24-луночной пластины 300 мкл раствора ламинина 521 (5 мкг/мл) при 37 °C в течение не менее 2 ч. Аккуратно удалите раствор покрытия и добавьте 300 мкл свежей среды mTeSR1, дополненной ингибитором ROCK 10 мкМ, в каждую лунку, а затем поместите пластину обратно в инкубатор для приема клеток.ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания пластин в любой момент при удалении раствора ламининового покрытия. Переместите запас HPSC из инкубатора, удалите отработанную среду, а затем промыть клетки один раз, используя 1 мл стерильного 1x DPBS. Добавьте 1 мл нежного реагента диссоциации клеток в каждую лунку 6-луночной пластины и инкубируйте при 37 °C в течение 6-8 мин для диссоциации клеток.ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно постучите по тарелке и проверьте, могут ли клетки легко отсоединиться, чтобы решить, достаточно ли долгое пищеварение. Осторожно пипетку вверх и вниз с помощью наконечника P1000, чтобы снять все HPSC. Прекратить диссоциацию путем добавления 2 мл свежей среды mTeSR1, дополненной ингибитором ROCK 10 мкМ (Y-27632) к клеточной суспензии. Хорошо перемешайте и переложите одноэлементную суспензию в пробирку объемом 50 мл и центрифугу при 200 х г в течение 3 мин при комнатной температуре. Удаляют супернатант и хорошо восстанавливают клетки в свежей среде mTeSR1 объемом 2 мл, дополненной ингибитором ROCK 10 мкМ. Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра. Используйте Trypan Blue для окрашивания и исключения мертвых клеток. Перенесите 8 x 105 до 1 x 106 живых клеток в трубку 1,5 мл для каждой реакции нуклеофекции и центрифугу при 200 x g в течение 3 мин. Затем осторожно аспирируйте надосадочную. Смешайте 3 мкг парных плазмид экспрессии Cas9n-sgRNA и 5 мкг векторной плазмиды-мишени в 100 мкл смешанного раствора/добавки для нуклеофекции из набора нуклеофекции стволовых клеток человека. Используйте контрольную плазмиду GFP из комплекта и приготовьте смесь контрольных плазмид GFP.ПРИМЕЧАНИЕ: Важно сделать макси-преп всех плазмид, чтобы уменьшить загрязнение эндотоксинами до нуклеофекции. Концентрация плазмид должна составлять приблизительно 1 мкг/мкл. Используйте смесь ДНК (объем ~ 111 мкл) для повторного суспендирования подготовленных клеток и переноса ее в электропорационную кювету (поставляется с набором нуклеофекции), избегая пузырьков. Электропорировать клетки с помощью нуклеофекционного устройства, выбирая оптимизированные условия для плюрипотентных стволовых клеток человека.ПРИМЕЧАНИЕ: Если нуклеофекционный набор для плюрипотентных стволовых клеток человека используется впервые, необходимо протестировать программу электропорации и выбрать наиболее эффективную. Немедленно добавьте 500 мкл свежей и теплой среды с температурой 37 °C mTeSR1, дополненной ингибитором ROCK 10 мкМ, в электропорированные клетки. Переложите смесь в 2 лунки 24-луночной плиты, приготовленной из этапов 3.2 и 3.3. Быстро поместите пластину обратно в инкубатор 37 °C / 5% CO2 и дайте клеткам восстановиться. Через 12-16 ч измените среду поддержания клеток. Если клетки установили клеточно-клеточный контакт, отзовите ингибитор ROCK, если нет, продолжайте дополнять среду ингибитором. Между 24-48 ч проверьте эффективность нуклеофекции, изучив экспрессию GFP в контрольных клетках. GFP-положительные клетки должны быть не менее 30 процентов. Через 48 ч после нуклеофекции начинайте отбор клеток, дополняя среду mTeSR1 1 мкг/мл пуромицина. Через 72 ч после нуклеофекции дополните среду mTeSR1 0,5 мкг/мл пуромицина. Если слияние клеток ниже 30%, также дополните среду ингибитором ROCK 10 мкМ. Через 4-6 дней после нуклеофекции проходят пуромицин-резистентные клетки до 10-15 х 96-луночных пластин при концентрации 0,8 клетки/лунка.ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо дополнить среду ингибитором ROCK 10 мкМ и пуромицином 0,5 мкг/мл. Поддерживайте эти клетки при 37 °C / 10% CO2 в течение 10-12 дней, образуя колонии, полученные из одной клетки. Доливайте средним один раз через 7 дней после посева.ПРИМЕЧАНИЕ: Повышенный уровень CO2 помогает отдельным HPSC формировать колонии из нашего опыта. Пометьте скважины, содержащие одну колонию, и замените среду свежей средой mTeSR1, содержащей 0,5 мкг/мл пуромицина, но без ингибитора ROCK.ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента клетки будут выращиваться при 37 °C / 5% CO2. Через два дня меняют среду для скважин, содержащих недифференцированные колонии. Дополните среду ингибитором ROCK 10 мкМ и пуромицином 0,5 мкг/мл.ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых скважинах клетки могут дифференцироваться и должны быть выброшены. Используйте наконечники пипеток P2, чтобы аккуратно соскоблить колонии. Перенесите клеточную суспензию, полученную из одной колонии, в 2 новые скважины на отдельных 96-луночных пластинах и используйте одну для генотипирования и одну для поддержания.ПРИМЕЧАНИЕ: Важно тщательно поддерживать колонии и сводить уровень спонтанной дифференциации к минимуму. Возьмите пластину, содержащую клетки, для генотипирования, как только слияние в большинстве скважин достигнет 50% или выше. Сбросьте отработанную среду, а затем промыть ячейки один раз с помощью DPBS. Лизируйте клетки в хорошо, используя буфер лизиса Брэдли, и изолируйте геномную ДНК из каждой лунки в пластине в соответствии с соответствующим протоколом (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate). Используют метод ПЦР с тремя праймерными соединениями для генотипирования как левой, так и правой гомологии рук независимо10.ПРИМЕЧАНИЕ: Схема, показывающая метод ПЦР, представлена на рисунке 2. Отправьте соединительные продукты ПЦР для обоих гомологических рукавов из 4-5 колоний для секвенирования Сэнгера и получите последовательности.ПРИМЕЧАНИЕ: Результат секвенирования 2 установленных колоний показан на рисунке 3А. Сохраните колонии с правильным генотипом и отбросьте остальные. Расширяйте правильные колонии при непрерывном отборе пуромицина и замораживайте их при скорейшем прохождении. 4. Удаление транспозона из целевых плюрипотентных стволовых клеток человека Поддерживать одну колонию с правильным генотипом под 0,5 мкг/мл отбора пуромицина. Нуклеофект 8 х 105 до 1 106 клеток с гиперактивной транспозазой 5 мкг (pCMV-hyPBase), как описано выше (Раздел 3, этапы 3.4-3.18). Выполняйте управляющую нуклеофекцию GFP параллельно.ПРИМЕЧАНИЕ: Пуромицин должен быть удален из среды mTeSR1 сразу после нуклеофекции этих клеток. Выращивайте и просчитывайте клетки с помощью кассеты выбора puro-deltaTK, удаленной в соответствии с опубликованными процедурами10.ПРИМЕЧАНИЕ: Важно тщательно следовать первоначальным процедурам. FIAU, или 1-(2-дезокси-2-фтор-β-d-арабинофуранозил)-5-йодурацил), использовался в качестве аналога тимидина для отрицательного отбора, полученного из вируса простого герпеса тимидинкиназы (HSV-tk). Упорядочить измененную область, чтобы подтвердить удаление транспозона.ПРИМЕЧАНИЕ: Результат секвенирования 3 установленных колоний показан на рисунке 3B. Сохраняйте колонии с правильным генотипом и расширяйте для дальнейшего использования. Выполните характеристику маркеров плюрипотентности в выбранных колониях, прежде чем использовать их для дальнейшего анализа.ПРИМЕЧАНИЕ: Характеристика двух установленных колоний показана на рисунке 4.