إدخال طفرات نقطية في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات باستخدام تحرير الجينوم السلس
Summary
هنا ، نصف طريقة مفصلة لتحرير الجينات السلس في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات باستخدام بلازميد متبرع قائم على الخنزير وطفرة Cas9 nickase. تم إدخال طفرات نقطتين في إكسون 8 من موضع العامل النووي للخلايا الكبدية 4 ألفا (HNF4α) في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs).
Abstract
تتيح نوكلياز الداخلية المصممة خصيصا ، مثل التكرارات العنقودية المتداخلة بانتظام (CRISPR) -Cas9 الموجهة بالحمض النووي الريبي ، تحرير الجينوم الفعال في خلايا الثدييات. هنا نصف الإجراءات التفصيلية لتحرير الجينوم بسلاسة لموضع العامل النووي للخلايا الكبدية 4 ألفا (HNF4α) كمثال في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. من خلال الجمع بين بلازميد متبرع قائم على الخنزير ومتحولة نيكاز CRISPR-Cas9 في اختيار جيني من خطوتين ، نظهر الاستهداف الصحيح والفعال لموضع HNF4α.
Introduction
تمثل الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) مصدرا غير محدود للخلايا الجسدية للبحث أو العيادة1. يوفر استهداف الجينات في hPSCs طريقة قوية لدراسة وظيفة الجينات أثناء مواصفات الخلية وفهم آليات المرض. على الرغم من وجود طرق فعالة لتحرير الجينوم ، إلا أن تعديل الجينات في hPSCs لا يزال يمثل تحديا تقنيا. يحدث الاستهداف الجيني القياسي عن طريق إعادة التركيب المتماثل في hPSCs بتردد منخفض أو حتى لا يمكن اكتشافه في بعض الجينات 2 ، وبالتالي فإن الاستهداف الجيني المحفز لكسر الحمض النووي المزدوج (DSB) (يسمى تحرير الجينات) ضروري في هذه الخلايا 2,3. بالإضافة إلى ذلك ، فإن نقل hPSCs والاستنساخ اللاحق لخلية واحدة ليس فعالا للغاية ، على الرغم من أنه يمكن تقليل موت الخلايا المبرمج المرتبط بخلية واحدة من خلال استخدام مثبط بروتين كيناز المرتبط ب Rho (ROCK)4. وأخيرا، يمكن أن تكون الطفرات المحتملة على الهدف وغير المستهدف في الجين محل الاهتمام مشكلة أيضا. وبالتالي ، فإن البروتوكول الموثوق به ضروري لإجراء تغييرات جينية مخصصة في hPSCs.
تعد تقنية CRISPR الموجهة بالحمض النووي الريبي (التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام) وتقنية البروتين 9 المرتبط ب CRISPR (Cas9) الآن أداة راسخة في تحرير الجينات. يشكل الحمض النووي الريبي المكتوب كريسبر (crRNA) والحمض النووي الريبي المنشط (tracrRNA) الحمض النووي الريبي الموجه الفردي (sgRNA) ، والذي يتجمع مع بروتين Cas9 مما يسمح بالانقسام النوعيللجين 5. نظام CRISPR / Cas9 قابل للبرمجة ، عن طريق تغيير تسلسل دليل 20 بت في 20 بت من sgRNA ، مما يعني أنه يمكن تحرير أي موضع تقريبا يفي بمتطلبات الشكل المجاور للمسافة الأولية (PAM). ومع ذلك ، يمكن للنوع البري Cas9 تحمل بعض عدم التطابق بين تسلسل الدليل وهدف الحمض النووي ، مما قد يتسبب في تأثيرات غير مرغوب فيها خارج الهدف. لتحسين خصوصيته ، تم تطوير متحولة نيكاز (Cas9n). يمتلك Cas9n الذي يحتوي على طفرة D10A أو N863A مجالا وظيفيا واحدا فقط للنيوكلياز ونتيجة لذلك يمكنه فقط شق الحمض النووي على شريط واحد. يمكن لزوج من Cas9n متباعدة وموجهة بشكل مناسب أن يحفز بشكل فعال DNA DSB ويتم تقليل التأثيرات خارج الهدف بشكل كبير6. لضمان تعديل Cas9n الفعال ، فقد ثبت أنه يجب وضع اثنين من Cas9n-sgRNA بشكل مثالي مع إزاحة -4 إلى 20 نقطة أساس وإنشاء دائما 5 ‘متدلية6.
يمكن استخدام DSB الناجم عن Cas9 (n) -sgRNA لتحرير الجينوم في hPSCs 7,8. يمكن أن يخلق ضربة قاضية للجين عن طريق إصلاح الانضمام النهائي غير المتماثل ، أو إدخال تعديل الجينات من خلال الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) إذا كان قالب الحمض النووي للمتبرع موجودا. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا بلازميد مانح قائم على ناقل الحركة (أو ناقل استهداف) ل HDR ، حيث يتم إحاطة علامة مقاومة الأدوية بالتكرارات المقلوبة للترانسبوزون. تشمل ميزة هذا النهج الفحص الفعال والتحرير الجيني السلس كما هو موضح أولا بواسطة Yusa et al.9,10. يسمح شريط اختيار الدواء بإثراء الخلايا بالناقل المتكامل ، والذي يتم فحصه لاحقا بواسطة PCR الوصلة لتحديد تلك المشتقة من HDR. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن وضع شريط اختيار الدواء ليحل محل التسلسلات المستهدفة لانقسام Cas9 (n) ، لذلك لا يحدث مزيد من كسر الحمض النووي بعد HDR ، وبالتالي القضاء على الطفرات المستهدفة “على” الناتجة عن إعادة الانقسام Cas9 (n). علاوة على ذلك ، من خلال استغلال الاستئصال الدقيق الذي يحفزه ناقلة نقل الخنازير ، يتم بعد ذلك استئصال علامة الاختيار من الجينوم دون ترك ندبة. يبقى فقط تسلسل TTAA الأصلي الداخلي لإدخال الخنزير بعد إزالة علامة اختيار الدواء9. حتى إذا كان لا بد من إنشاء مواقع TTAA عن طريق إدخال بدائل ، فإن فرص العناصر التنظيمية المزعجة تقل مقارنة بالطرق الأخرى10.
هنا نصف الإجراءات التفصيلية لتنفيذ تحرير الجينوم السلس في hPSCs. من خلال الجمع بين بلازميد متبرع قائم على الخنزير ومتحور نيكاز CRISPR-Cas9 في اختيار جيني من خطوتين ، قدمنا طفرتين نقطيتين محددتين مسبقا في جين العامل النووي 4 ألفا (HNF4α)11. هذا النهج موثوق وفعال ، وقد سمح بإجراء تحليلات متعمقة للأدوار المهمة التي يلعبها HNF4α في مواصفات الأديم الباطن وخلايا الكبد من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات11.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن استخدام البروتوكول الموصوف هنا لإدخال طفرات نقطية محددة مسبقا في موضع داخلي المنشأ في hPSCs. أثبت الجمع بين ناقل الاستهداف القائم على الخنزير وبلازميدات التعبير CRISPR / Cas9n المزدوجة أنه موثوق وفعال11. بعد تحرير الجينات HNF4α ، تم استهداف 12 من أصل 43 نسخة مستنسخة تم تحليلها بشكل صحيح على النحو الذي يحدده فحص PCR للوصلة. على وجه التحديد ، كانت كفاءة الاستهداف biallelic حوالي 21٪ (9/43) وكانت كفاءة الاستهداف أحادي الأليل حوالي 7٪ (3/43).
بعد تجارب الاستهداف ، من الأهمية بمكان الحفاظ على اختيار البوروميسين للحفاظ على الموضع المستهدف في متناول الخنزير transposase خلال الجولة الأولى من الفحص. سيؤدي ذلك إلى تقليل إسكات شريط اختيار puro-deltaTK الذي يحركه مروج PGK وتقليل الخلفية في الجولة الثانية من الفحص10. أظهر تقرير حديث أن مروج CAG أكثر مقاومة للإسكات من مروج PGK في hPSCs14. وبالتالي فإن تغيير المروج لشريط الاختيار يمكن أن يحسن هذا النظام في المستقبل. من المهم أيضا مقارنة عدد المستعمرات المقاومة من الخلايا المنقولة hyPBase و GFP. عند الإزالة الناجحة للترانسبوزون ، يجب أن يكون هناك المزيد من المستعمرات الباقية من hyPBase- أكثر من الخلايا المنقولة GFP. بالإضافة إلى تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل لاستئصال الترانسبوزون ، يلزم التسلسل المباشر للمنطقة المعدلة لتأكيد دقة الختان.
استنادا إلى استراتيجية ناقل الاستهداف9،10 القائمة على ناقل الحمولة 9،10 من Yusa ، ركزت الإجراءات المفصلة أعلاه على تحسين نواة hPSCs وكفاءة استنساخ الخلية الواحدة. تم تحسين كثافة بذر الخلايا لتقليل احتمالية تكوين مستعمرة غير متجانسة. استخدمنا أيضا استزراع لمدة 10-12 يوما أقل من 10٪ CO2 لتعزيز إنتاج المستعمرة لفحص النمط الوراثي. في تجربتنا ، يمكن الحصول على حوالي 20 مستعمرة من كل لوحة 96 بئر. على الرغم من أن هذه الخطوة قد تستغرق وقتا أطول من الطرق الأخرى ، إلا أنها موثوقة وعالية الكفاءة.
بناء على الحاجة ، يمكن تصميم ناقلات الاستهداف لإدخال أو تصحيح طفرات النقاط ، لإنشاء خطوط خلايا مراسلة ، بالإضافة إلى التعبير الجيني بالضربة القاضية. في الختام ، يعد الجمع بين نظام CRISPR / Cas9 (n) وناقل الاستهداف طريقة فعالة لتقديم أنواع مختلفة من hPSCs المعدلة وراثيا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر Kosuke Yusa على مشاركة بلازميدات pMCS-AAT_PB-PGKpuroTK و pCMV-hyPBase. نشكر جيا يين يانغ وكارامجيت سينغ دولت على المناقشات المفيدة حول تحرير الجينوم. يتم دعم مختبر DCH بجائزة من مكتب كبير العلماء (TC / 16/37) ومنصة الطب التجديدي في المملكة المتحدة (MR / L022974 / 1). تم دعم YW من خلال منحة دكتوراه ممولة من مجلس المنح الدراسية الصيني وجامعة إدنبرة.
Materials
| Anti-Human SSEA4 PE | eBioscience | 12-8843-42 | |
| Anti-Human TRA-1-60 PE | eBioscience | 11-0159-42 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| DPBS with calcium and magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| FIAU | Moravek | M251 | |
| Gentle cell dissociation reagent | Stem Cell Technologies | 07174 | |
| H9 human embryonic stem cells | WiCell | WA09 | |
| Human NANOG antibody | R&D systems | AF1997 | |
| Human OCT4 antibody | Abcam | AB19857 | |
| Human stem cell Nucleofector kit 1 | Lonza | VPH-5012 | |
| Mouse IgG3 isotype control PE | eBioscience | 12-4742-41 | |
| mTeSR1 medium | Stem Cell Technologies | 85850 | |
| Nucleofector 2b device | Lonza | AAB-1001 | |
| pCMV-hyPBase | Wellcome Trust Sanger Institute | N/A | |
| pMCS-AAT_PBPGKpuroTK | Wellcome Trust Sanger Institute | N/A | |
| pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462) | Addgene | PX462 | |
| Puromycin dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A11138-03 | |
| QIAprep spin maxiprep kit | Qiagen | 12162 | |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
| Recombinant laminin 521 | BioLamina | LN521 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Y-27632(Dihydrochloride) | Millipore | SCM075 |
References
- Rashidi, H., et al. 3D human liver tissue from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo. Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Porteus, M. H., Baltimore, D. Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells. Science. 300 (5620), 763 (2003).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-822 (2012).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-824 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Yusa, K., et al. Targeted gene correction of α1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells. Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).
- Yusa, K. Seamless genome editing in human pluripotent stem cells using custom endonuclease-based gene targeting and the piggyBac transposon. Nature Protocols. 8 (10), 2061-2078 (2013).
- Wang, Y., et al. Multiomics Analyses of HNF4α Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation. iScience. 16, 206-217 (2019).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (121), 1-8 (2017).
- Eggenschwiler, R., et al. Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in patient-derived iPSC by Cas9 nickase. Scientific Reports. 6, 1-14 (2016).
