Introductie van puntmutaties in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van naadloze genoombewerking

1. Ontwerpen en construeren van CRISPR/Cas9n-sgRNA expressie plasmiden Zoek naar 20-bp gidssequenties direct stroomopwaarts van een 5′-NGG in de buurt van de te wijzigen site. Een paar single-guide RNA’s (sgRNA’s) is nodig wanneer de Cas9 nickase (Cas9n) van Streptococcus pyogenes wordt gebruikt. Het paar sgRNA’s moet in staat zijn om 5′ overhangen te genereren bij het nicken met een -4 tot 20 bp offset6. Bestel noodzakelijke oligos en pSpCas9n-2A-puro vector. Kloon sgRNA in de pSpCas9n-vector voor co-expressie met Cas9n volgens het gepubliceerde protocol12. 2. Ontwerpen en construeren van een piggyBac-gebaseerde targeting vector Download de doelgensequentie en zoek naar een TTAA-site in de buurt van de site die moet worden gewijzigd.OPMERKING: De afstand tussen de TTAA-site en de te wijzigen site moet zo klein mogelijk zijn. Als binnen de coderingssequentie en er geen TTAA-site aanwezig is binnen een afstand van 100 bp, is het noodzakelijk om er een te introduceren door synonieme nucleotidesubstituties te maken. Ontwerp homologiearmen (HAs) en neem gewenste puntmutaties op in de HAs. De optimale lengte van HAs moet ongeveer 500 – 1200 bp zijn.OPMERKING: Het wordt aanbevolen om synonieme nucleotidesubstituties te introduceren om de PAM-sequentie te muteren om mogelijke Cas9n-splitsing te voorkomen. Construeer de uiteindelijke targetingvector volgens een vastgesteld protocol10.OPMERKING: In de hier gebruikte targetingvector wordt een pgk promotor gedreven puro-deltaTK selectiecassette geflankeerd door transposon omgekeerde herhalingen. 3. Genetische bewerking van menselijke pluripotente stamcellen Onderhoud menselijke pluripotente stamcellen (hPSC’s) in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 op recombinante laminine 521-gecoate oppervlakken (5 μg/ml) in mTeSR1 medium13. De cellen moeten na 72 uur 70-85% confluency bereiken na een splitverhouding van 1:3.OPMERKING: Verwijder, indien aanwezig, spontaan gedifferentieerde cellen voordat het dagelijkse medium verandert door ze voorzichtig weg te halen. Bekleed op de dag van transfectie voldoende putjes van een 24-wellsplaat met 300 μL van de laminine 521-oplossing (5 μg/ml) bij 37 °C gedurende ten minste 2 uur. Verwijder de coatingoplossing voorzichtig en voeg 300 μL vers mTeSR1-medium aangevuld met 10 μM ROCK-remmer toe aan elke put en plaats de plaat vervolgens terug naar de incubator om cellen te ontvangen.OPMERKING: Laat de platen op geen enkel moment drogen wanneer de lamininecoatingoplossing wordt verwijderd. Verplaats de voorraad hPSC’s uit de incubator, verwijder het gebruikte medium en was de cellen eenmaal met 1 ml steriele 1x DPBS. Voeg 1 ml zachtcellig celdissociatiereagens toe aan elk putje van een 6-wellsplaat en incubeer bij 37 °C gedurende 6-8 minuten om de cellen te dissociëren.OPMERKING: Tik voorzichtig op het bord en controleer of de cellen gemakkelijk kunnen loskomen om te beslissen of de spijsvertering lang genoeg is. Pipetteer voorzichtig op en neer met behulp van een P1000-punt om alle hPSC’s op te tillen. Beëindig de dissociatie door 2 ml vers mTeSR1-medium aangevuld met 10 μM ROCK-remmer (Y-27632) aan de celsuspensie toe te voegen. Meng goed en breng de eencellige suspensie over in een buis van 50 ml en centrifugeer bij 200 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspenseer de cellen goed in 2 ml vers mTeSR1-medium aangevuld met 10 μM ROCK-remmer. Tel de levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer. Gebruik Trypan Blue om dode cellen te kleuren en uit te sluiten. Breng 8 x 105 tot 1 x 106 levende cellen over naar een buis van 1,5 ml voor elke nucleofectiereactie en centrifugeer bij 200 x g gedurende 3 minuten. Adem vervolgens voorzichtig het supernatant op. Meng 3 μg van de gepaarde Cas9n-sgRNA-expressieplasmiden en 5 μg targeting vectorplasmide in 100 μL gemengde nucleofectionoplossing/supplement uit de humane stamcel nucleofection kit. Gebruik het GFP-controleplasmide uit de kit en bereid ook een GFP-controleplasmidemix voor.OPMERKING: Het is belangrijk om een maxi-prep te maken van alle plasmiden om endotoxinebesmetting vóór nucleofection te verminderen. De concentratie van de plasmiden moet ongeveer 1 μg/μL zijn. Gebruik het DNA-mengsel (volume ~111 μL) om de voorbereide cellen opnieuw te resuspenderen en over te brengen naar een elektroporatiecuvet (geleverd met de nucleofectionkit), waarbij bellen worden vermeden. Elektroporateer de cellen met behulp van het nucleofectionapparaat door de geoptimaliseerde omstandigheden voor menselijke pluripotente stamcellen te selecteren.OPMERKING: Als u de nucleofectionkit voor menselijke pluripotente stamcellen voor de eerste keer gebruikt, is het noodzakelijk om het elektroporatieprogramma te testen en de meest efficiënte te kiezen. Voeg onmiddellijk 500 μL vers en warm tot 37 °C mTeSR1 medium aangevuld met 10 μM ROCK-remmer toe aan de elektroporated cellen. Breng het mengsel over in 2 putten van een 24-wells plaat bereid uit stap 3.2 en 3.3. Leg de plaat snel terug naar de 37 °C/5% CO2 incubator en laat de cellen herstellen. 12-16 uur later, verander het onderhoudsmedium van de cel. Als de cellen cel-celcontact hebben gemaakt, trek dan de ROCK-remmer terug, zo niet, ga dan door met het aanvullen van het medium met de remmer. Controleer tussen 24-48 uur de nucleofection-efficiëntie door de GFP-expressie in de controlecellen te onderzoeken. GFP-positieve cellen moeten minstens 30 procent zijn. Begin 48 uur na nucleofection met het selecteren van cellen door het mTeSR1-medium aan te vullen met 1 μg / ml puromycine. 72 uur na nucleofection, vul het mTeSR1 medium aan met 0,5 μg/ml puromycine. Als de celconfluentie lager is dan 30%, vul het medium dan ook aan met 10 μM ROCK-remmer. 4-6 dagen na nucleofection, passeer de puromycine-resistente cellen naar 10-15 x 96-well platen in de concentratie van 0,8 cellen / put.OPMERKING: Het is essentieel om het medium aan te vullen met 10 μM ROCK-remmer en 0,5 μg / ml puromycine. Houd die cellen gedurende 10-12 dagen op 37 °C/10% CO2 om van één cel afgeleide kolonies te vormen. Herlaad medium eenmaal 7 dagen na het zaaien.OPMERKING: Een verhoogd CO2-niveau helpt enkele hPSC’s om kolonies te vormen vanuit onze ervaring. Markeer putten die een enkele kolonie bevatten en vervang het medium door vers mTeSR1-medium met 0,5 μg / ml puromycine, maar geen ROCK-remmer.OPMERKING: Vanaf dit punt worden de cellen gekweekt onder 37 °C/5% CO2. Twee dagen later, verander medium voor putten met ongedifferentieerde kolonies. Vul het medium aan met 10 μM ROCK-remmer en 0,5 μg/ml puromycine.OPMERKING: In sommige putten kunnen de cellen zijn gedifferentieerd en moeten ze worden weggegooid. Gebruik P2 pipetpunten om de kolonies voorzichtig af te schrapen. Breng de celsuspensie afgeleid van één kolonie over in 2 nieuwe putten op afzonderlijke platen met 96 putten en gebruik er een voor genotypering en een voor onderhoud.OPMERKING: Het is belangrijk om de kolonies zorgvuldig te onderhouden en het spontane differentiatieniveau tot een minimum te beperken. Neem de plaat met cellen voor genotypering uit zodra de samenvloeiing in de meeste putten 50% of hoger bereikte. Dump het gebruikte medium en was de cellen eenmaal met DPBS. Lyse de cellen in put met behulp van Bradley lysis buffer en isoleer genomisch DNA uit elke put in de plaat volgens geassocieerd protocol (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate). Gebruik een pcr-methode met drie primers junctie om zowel de linker- als de rechter homologiearmen onafhankelijk van elkaar tegenotyperen 10.OPMERKING: Een schema met de PCR-methode is weergegeven in figuur 2. Stuur de junctie PCR-producten voor beide homologiearmen van 4-5 kolonies voor Sanger-sequencing en krijg de sequenties.OPMERKING: Het sequencingresultaat van 2 gevestigde kolonies is weergegeven in figuur 3A. Houd kolonies met het juiste genotype en gooi de rest weg. Breid de juiste kolonies uit onder continue puromycineselectie en vries ze in bij de vroegst mogelijke passage. 4. Transposon verwijderen uit gerichte menselijke pluripotente stamcellen Onderhoud één kolonie met het juiste genotype onder 0,5 μg / ml puromycine selectie. Nucleofect 8 x 105 tot 1 x 106 cellen met 5 μg hyperactief transposase (pCMV-hyPBase) zoals hierboven beschreven (sectie 3, stappen 3.4-3.18). Voer parallel een GFP-controlenucleofection uit.OPMERKING: Puromycine moet onmiddellijk na het nucleofecteren van deze cellen uit het mTeSR1-medium worden verwijderd. Kweek en screen op cellen met de puro-deltaTK selectiecassette verwijderd volgens gepubliceerde procedures10.OPMERKING: Het is belangrijk om de oorspronkelijke procedures zorgvuldig te volgen. FIAU, of 1-(2-deoxy-2-fluoro-β-d-arabinofuranosyl)-5-jodouracil), werd gebruikt als thymidine-analoog voor van herpes simplex-virus afgeleide thymidinekinase (HSV-tk)-gebaseerde negatieve selectie. Volg het gewijzigde gebied op om de verwijdering van de transposon te bevestigen.OPMERKING: Het sequencingresultaat van 3 gevestigde kolonies is weergegeven in figuur 3B. Houd kolonies met het juiste genotype en breid uit voor verder gebruik. Voer karakterisering van pluripotentiemarkers uit in de gekozen kolonies voordat u ze gebruikt voor verdere analyse.OPMERKING: De karakterisering van twee gevestigde kolonies is weergegeven in figuur 4.