Mappatura ad alta risoluzione delle interazioni proteina-DNA nei neuroni derivati dalle cellule staminali del topo utilizzando l'immunoprecipitazione-esonucleasi della cromatina (ChIP-Exo)

Le posizioni delle interazioni proteina-DNA forniscono informazioni sui meccanismi di regolazione genica. L’immunoprecipitazione della cromatina accoppiata con il sequenziamento ad alta produttività (ChIP-seq) è stata utilizzata per un decennio per esaminare le interazioni proteina-DNA a livello genomico nelle^{cellule viventi 1,2}. Tuttavia, il metodo ChIP-seq è limitato dall’eterogeneità nella frammentazione del DNA e dalla contaminazione del DNA non legato che porta a bassa risoluzione di mappatura, falsi positivi, chiamate perse e segnale di fondo non specifico. La combinazione di ChIP con digestione dell’esonucleasi (ChIP-exo) migliora il metodo ChIP-seq tagliando il DNA ChIP ai punti di collegamento incrociato proteina-DNA, fornendo una risoluzione vicina alla coppia di basi e un basso segnale di fondo^3,4,5. La risoluzione di mappatura notevolmente migliorata e il basso background fornito da ChIP-exo consentono di determinare posizioni di legame proteina-DNA accurate e complete in tutto il genoma. ChIP-exo è in grado di rivelare motivi di legame del DNA funzionalmente distinti, interazioni cooperative tra fattori di trascrizione (TF) e più siti di collegamento incrociato proteina-DNA in una certa posizione di legame genomico, non rilevabili da altri metodi di mappatura^{genomica 3,4,6,7}.

ChIP-exo è stato inizialmente utilizzato nel lievito in erba per esaminare il legame dna specifico della sequenza dei TF, per studiare l’organizzazione precisa del complesso di pre-iniziazione della trascrizione e la struttura sub-nucleosomica dei singoli istoni^{attraverso il genoma 4,8,9}. Dalla sua introduzione nel 2011⁴, ChIP-exo è stato utilizzato con successo in molti altri organismi tra cui batteri, topi e cellule umane^{7,10,11,12,13,14,15,16,17}. ^Nel 2016, Rhee et al. Questo studio ha dimostrato che in assenza di Lhx3, Isl1 viene reclutato in nuovi esaltatori neuronali legati da Onecut1 TF per mantenere l’espressione genica dei geni dell’effettore neuronale. In questo studio, ChIP-exo ha rivelato come più TF riconoscano dinamicamente il tipo di cellula e gli elementi regolatori del DNA specifici dello stadio cellulare in modo combinatorio a una risoluzione di mappatura quasi nucleotidica. Altri studi hanno anche usato il metodo ChIP-exo per comprendere l’interazione tra proteine e DNA in altre linee cellulari di mammiferi. Han et al.^{7 usò} chip-exo per esaminare l’organizzazione a livello genomico dei TF GATA1 e TAL1 nelle cellule erythroid del topo usando chIP-exo. Questo studio ha scoperto che tal1 viene reclutato direttamente nel DNA piuttosto che indirettamente attraverso interazioni proteina-proteina con GATA1 durante la differenziazione erythroid. Studi recenti hanno anche utilizzato ChIP-exo per profilare le posizioni di legame a livello genomico di CTCF, RNA Polimerasi II e segni istonografici per studiare i meccanismi epigenomici e trascrizionale nelle linee^{cellulari umane 18,19}.

Esistono diverse versioni del protocollo ChIP-exo disponibili^3,5,20. Tuttavia, questi protocolli ChIP-exo sono difficili da seguire per le ricerche che non hanno familiarità con la preparazione della libreria di sequenziamento di nuova generazione. Un’eccellente versione del protocollo ChIP-exo è stata pubblicata con istruzioni facili da seguire e un video²¹, ma conteneva molti passaggi enzimatici che richiedono una notevole quantità di tempo per il completamento. Qui si segnala una nuova versione del protocollo ChIP-exo contenente passaggi enzimatici ridotti e tempi di incubazione e spiegazioni per ogni fase enzimatica²¹. Le reazioni di riparazione finale e di coda dA sono combinate in un unico passaggio utilizzando l’enzima di preparazione finale. I tempi di incubazione per i passaggi di lisciviazione dell’indice e dell’adattatore universale sono ridotti da 2 h a 15 minuti utilizzando un esaltatore di legatura. La reazione della chinasi dopo il passaggio di legatura della scheda di indice descritto nel precedente protocollo ChIP-exo è stata rimossa. Al contrario, durante la sintesi del DNA dell’oligo viene aggiunto un gruppo fosfato a una delle 5′ estremità dell’adattatore indice (Tabella 1), che verrà utilizzato per la fase di digestione dell’esonucleasi lambda. Mentre il precedente protocollo ChIP-exo utilizzava la digestione dell’esonucleasi RecJ_f per eliminare i contaminanti di DNA a singolo filamento, questo passaggio di digestione viene rimosso qui perché non è fondamentale per la qualità della libreria ChIP-exo. Inoltre, per purificare il DNA inverso incrociato dopo l’eluizione del ChIP, viene utilizzato un metodo di purificazione magnetica delle perline al posto del metodo di estrazione fenolo:cloroformio:alcol isoamile (PCIA). Ciò riduce i tempi di incubazione dell’estrazione del DNA. È importante sottolineare che rimuove la maggior parte dei dimeri della scheda formati durante la legatura della scheda di indicizzazione, il che può influire sull’efficienza della PCR mediata dalla legatura.

Il protocollo ChIP-exo qui presentato è ottimizzato per il rilevamento di precise interazioni proteina-DNA nei neuroni dei mammiferi differenziati dalle cellule staminali embrionali del topo (ES). In breve, le cellule neuronali raccolte e incrociate vengono lese, per consentire alla cromatina di essere esposta alla sonicazione, quindi sonicate in modo da ottenere frammenti di DNA di dimensioni appropriata (Figura 1). Le perline rivestite di anticorpi vengono quindi utilizzate per immunoprecipitato selettivamente la cromatina frammentata e solubile alla proteina di interesse. Mentre il DNA immunoprecipitato è ancora sulle perline, vengono eseguite la riparazione finale, la legatura degli adattatori di sequenziamento, la reazione di riempimento e le fasi di digestione delle esonucleasi lambda da 5′ a 3 ‘. La fase di digestione dell’esonucleasi è ciò che conferisce a ChIP-exo la sua altissima risoluzione e l’elevato rapporto segnale-rumore. L’esonucleasi lambda taglia il DNA immunoprecipitato alcune coppie di basi (bp) dal sito di reticolamento, causando così la degradazione del DNA contaminante. Il DNA ChIP trattato con esonucleasi viene eluita dalle perline rivestite di anticorpi, i collegamenti incrociati proteina-DNA sono invertiti e le proteine sono degradate. Il DNA viene estratto e denaturato in DNA ChIP a singolo filamento, seguito dalla ricottura del primer e dall’estensione per realizzare DNA a doppio filamento (dsDNA). Successivamente, viene eseguita la legatura di un adattatore universale alle estremità trattate con esonucleasi. Il DNA risultante viene purificato, quindi amplificato pcr, purificato in gel e sottoposto a sequenziamento di nuova generazione.

Il protocollo ChIP-exo è più lungo del protocollo ChIP-seq, ma non è molto impegnativo dal punto di vista tecnico. Qualsiasi DNA ChIP immunoprecipitato con successo può essere sottoposto a ChIP-exo, con diversi passaggi enzimatici aggiuntivi. I notevoli vantaggi del ChIP-exo, come la risoluzione di mappatura ultra-alta, un segnale di fondo ridotto e la diminuzione di falsi positivi e negativi, per quanto riguarda i siti di legame genomico, superano il costo del tempo.