クロマチン免疫沈降-エキソヌクレアーゼ(ChIP-Exo)を用いたマウス幹細胞由来ニューロンにおけるタンパク質-DNA相互作用の高分解能マッピング
Summary
ゲノム全体のタンパク質結合位置の正確な決定は、遺伝子調節を理解するために重要です。ここでは、クロマチン免疫沈降DNAをエキソヌクレアーゼ消化(ChIP-exo)に続けてハイスループットシーケンシングで処理するゲノムマッピング方法について説明します。この方法は、哺乳類ニューロンにおける近接塩基対マッピング分解能および高いシグナル対雑音比を用いてタンパク質とDNAの相互作用を検出する。
Abstract
ゲノム上の特異的タンパク質とDNA相互作用の同定は、遺伝子調節を理解するために重要である。ハイスループットシーケンシング(ChIP-seq)と組み合わせたクロマチン免疫沈降法は、DNA結合タンパク質のゲノム全体の結合場所を同定するために広く使用されています。しかし、ChIP-seq法は、超音波処理されたDNA断片および非特異的バックグラウンドDNAの長さの不均一性によって制限され、DNA結合部位におけるマッピング分解能と不確実性が低い結果となる。これらの制限を克服するために、ChIPとエキソヌクレアーゼ消化(ChIP-exo)の組み合わせは、5’〜3’エキソヌクレアーゼ消化を利用して、タンパク質-DNA架橋部位に異種サイズの免疫沈降DNAをトリミングする。エキソヌクレアーゼ処理は、非特異的なバックグラウンドDNAも除去する。ライブラリー調製およびエキソヌクレアーゼ消化 DNA は、ハイスループットシーケンシングのために送ることができます。ChIP-exo法は、より大きな検出感度と背景信号の低減を伴うニアペアマッピング分解能を可能にします。哺乳類細胞および次世代シーケンシング用に最適化されたChIP-exoプロトコルを以下に説明する。
Introduction
タンパク質とDNA相互作用の場所は、遺伝子調節のメカニズムに関する洞察を提供します。クロマチン免疫沈降とハイスループットシーケンシング(ChIP-seq)を組み合わせると、1,2の生細胞におけるゲノム全体のタンパク質とDNAの相互作用を調べるために10年間使用されてきた。しかし、ChIP-seq法は、低マッピング分解能、誤検出、不在着信、および非特異的バックグラウンド信号につながるDNA断片化および非結合DNA汚染における不均一性によって制限されています。ChIPとエキソヌクレアーゼ消化(ChIP-exo)の組み合わせは、ChIP DNAをタンパク質-DNA架橋点にトリミングすることにより、ChIP-seq法を改善し、ベースペアの分解能に近い分解能と低バックグラウンド信号3、4、5を提供する。ChIP-exoによって提供される大幅に改善されたマッピング分解能および低い背景はゲノム全体で決定される正確で、広範囲な蛋白質DNA結合の場所を可能にする。ChIP-exoは、機能的に異なるDNA結合モチーフ、転写因子(TF)との協調的相互作用、および特定のゲノム結合位置における複数のタンパク質−DNA架橋部位を明らかにすることができ、他のゲノムマッピング方法3、4、6、7では検出できない。
ChIP-exoは、最初は出芽酵母で使用され、TFの配列特異的DNA結合を調べ、転写開始前複合体の正確な組織を研究し、またゲノム4、8、9を横切る個々のヒストンの核下構造を研究した。2011年4月に導入されて以来、細菌、マウス、ヒト細胞7、10、11、12、13、14、15、16、17など、他の多くの生物に利用されています。2016年、Rhee et al.14は哺乳類ニューロンで初めてChIP-exoを使用して、別のプログラミングTF Isl1とヘテロダイマー複合体を形成するプログラミングTF Lhx3のダウンレギュレーション後にニューロン遺伝子発現がどのように維持されたかを理解した。この研究は、Lhx3がない場合、Isl1がニューロンエフェクター遺伝子の遺伝子発現を維持するためにOnecut1 TFによって結合された新しいニューロンエンハンサーに募集されることを示した。本研究では、複数のTFが、ほぼヌクレオチドマッピング分解能で、細胞型および細胞ステージ特異的DNA調節要素を組み合わせで動的に認識する方法を明らかにした。他の研究はまた、他の哺乳類細胞株におけるタンパク質とDNAの相互作用を理解するためにChIP-exo法を使用した。Han et al.7は、ChIP-exo を使用して、マウスエリスロイド細胞における GATA1 および TAL1 TF のゲノムワイド組織を調べるために、ChIP-exo を用いた。この研究では、TAL1はエリスロイド分化を通じてGATA1とタンパク質タンパク質相互作用を介して間接的ではなくDNAに直接リクルートされることを発見した。最近の研究はまた、ヒト細胞株18、19におけるエピゲノムおよび転写機構を研究するためにCTCF、RNAポリメラーゼII、およびヒストンマークのゲノムワイド結合位置をプロファイリングするためにChIP-exoを用いた。
ChIP-exoプロトコルには、3、5、20のバージョンが用意されています。しかし、これらのChIP-exoプロトコルは、次世代シーケンシングライブラリの準備に精通していない研究では従うのが難しいです。ChIP-exo プロトコルの優れたバージョンは、簡単に従う手順とビデオ21で公開されましたが、完了するまでにかなりの時間を要する多くの酵素的ステップが含まれていました。ここでは、酵素ステップとインキュベーション時間を削減したChIP-exoプロトコルの新しいバージョンと、各酵素ステップ21の説明を報告します。エンドリペアとdA-テーリング反応は、エンドプレップ酵素を用いた一回のステップで組み合わされます。インデックスおよびユニバーサルアダプターライゲーションステップのインキュベーション時間は、ライゲーションエンハンサーを使用して2時間から15分に短縮されます。キナーゼ反応は、上記のChIP-exoプロトコルに記載されたインデックスアダプタライゲーションステップ後に除去される。代わりに、オリゴDNA合成中にリン酸基が、ラムダエキソヌクレアーゼ消化ステップに使用されるインデックスアダプタの5’末端(表1)のいずれかに添加される。以前のChIP-exoプロトコルはRecJfエキソヌクレアーゼ消化を使用して一本鎖DNA汚染物質を排除しましたが、この消化ステップはChIP-exoライブラリの品質にとって重要ではないので、ここで取り除かれます。また、ChIP溶出後に逆架橋DNAを精製するために、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(PCIA)抽出法の代わりに磁気ビーズ精製法が用いられます。これにより、DNA抽出のインキュベーション時間が短縮されます。重要なことに、インデックスアダプタライゲーション中に形成されるアダプタダイマーの大部分を除去し、結紮媒介PCRの効率に影響を与える可能性があります。
ここで紹介するChIP-exoプロトコルは、マウス胚性幹細胞(ES)細胞と区別される哺乳類ニューロンにおける正確なタンパク質とDNA相互作用の検出に最適化されています。簡単に言えば、採取および架橋された神経細胞が溶解され、クロマチンが超音波処理にさらされることを可能にし、次に適切なサイズのDNA断片が得られるように超音波処理する(図1)。抗体被覆ビーズは、その後、目的のタンパク質に断片化した可溶性クロマチンを選択的に免疫沈降させるために使用されます。免疫沈降DNAがビーズ上に残っている間、エンドリペア、シーケンシングアダプターの結紮、フィルイン反応および5’〜3’ラムダエキソヌクレアーゼ消化ステップが行われる。エキソヌクレアーゼ消化ステップは、ChIP-exoに超高分解能と高い信号対雑音比を与えるものです。ラムダエキソヌクレアーゼは、免疫沈降DNAを架橋部位から数塩基対(bp)でトリミングし、汚染DNAを分解させる。エキソヌクレアーゼ処理のChIP DNAは、抗体被覆ビーズから溶出し、タンパク質-DNA架橋が逆転し、タンパク質が分解される。DNAを抽出し、一本鎖のChIP DNAに変性させ、続いてプライマーアニーリングおよび拡張して二本鎖DNA(dsDNA)を作る。次に、エキソヌクレアーゼ処理末端へのユニバーサルアダプターの結紮が行われる。得られたDNAを精製し、次いでPCR増幅し、精製し、次期シーケンシングを行う。
ChIP-exo プロトコルは ChIP-seq プロトコルよりも長いですが、技術的にはそれほど困難ではありません。正常に免疫沈降したChIP DNAは、いくつかの追加の酵素ステップで、ChIP-exoに供することができる。極度の高いマッピング解像度、背景信号の減少、ゲノム結合部位に関する偽陽性および陰性の減少などのChIP-exoの顕著な利点は、時間コストを上回る。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、ChIPに続いてエキソヌクレアーゼ消化を行い、超高マッピング解像度で哺乳類細胞におけるタンパク質とDNA相互作用を同定するためのDNAライブラリーを取得する。多くの変数は、ChIP-exo実験の品質に寄与します。重要な実験パラメータには、抗体の品質、超音波処理の最適化、およびLM-PCRサイクルの数が含まれます。これらの重要な実験パラメータは、ChIP-exo実験を制限?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
未発表のデータや貴重な議論を共有してくれたRhee研究所のメンバーに感謝します。この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)がRGPIN-2018-06404(H.R.)を助成金で支えました。
Materials
| Agarose, UltraPure | Invitrogen | 16500 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98% | BioShop | ALB003 | Blocking Solution |
| Antibody against Isl1 | DSHB | 39.3F7 | Antibody incuation with beads (Section 5.6) |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060010 | Sonicating Chromatin (Section 3.3) |
| Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade | New England BioLabs | B9000S | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4) |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 22623508 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1) |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer |
| dATP Solution | New England BioLabs | N0440S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | fisher scientific | BP349 | Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer |
| dNTP Mix, Molecular Biology Grade | Thermo Scientific | R0192 | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x | Thermo Scientific | K1081 | Ligation-Mediated PCR (Section 18.1) |
| EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0 | BioShop | EDT111 | Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ethyl Alcohol Anhydrous, 100% | Commercial alcohols | P006EAAN | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol | Sigma | F8775 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1) |
| Glycerol, Reagent Grade, min 99.5% | BioShop | GLY002 | Lysis Buffer 1 |
| Glycine, Biotechnology Grade, min. 99% | BioShop | GLN001 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2) |
| Glycogen, RNA Grade | Thermo Scientific | R0551 | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3 | BioShop | HEP003 | Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer |
| Klenow Fragment (3->5 exo-) | New England BioLabs | M0212S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Lambda exonuclease | New England BioLabs | M0262S | Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2) |
| Ligase Enhancer | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Ligase Master Mix | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade | Bioshop | LIT704 | LiCl Wash Buffer |
| Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Antibody incubation with beads (Section 5) |
| Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads) | Beckman Coulter | A63880 | DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1) |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Invitrogen | 12321D | Used in many steps in Sections: 5 – 11, 13 |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2) |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC) | Sigma | 61747 | Lysis Buffer 3 |
| Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630) | BioShop | NON999 | Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1) | BioShop | PHE512 | Checking Sonication (Section 4.3.1) |
| phi29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269L | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4) |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning | 21040CV | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1) |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| ProFlex PCR System | Applied Biosystems | ProFlex PCR System | Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2 |
| Protein LoBind Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3) |
| Proteinase K Solution, RNA Grade | Invitrogen | 25530049 | Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3) |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Quibit dsDNA BR assay kit | Invitrogen | Q32853 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Rnase A, Dnase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2) |
| Sodium chloride (NaCl), BioReagent | Sigma | S5886 | Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis Grade | BioShop | SDS001 | Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Sonication beads and 15 mL Bioruptor Tubes | Diagenode | C01020031 | Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2) |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2 |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4 | Sigma | T2194 | 10 mM Tris-HCl Buffer |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0 | Sigma | T2694 | Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn) | New England BioLabs | E7546S | End Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2) |
| VWR Mini Tube Rocker, Variable Speed | VWR | 10159-752 | Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7 |
| 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent Grade | BioShop | TRX506 | Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer |
References
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