Hochauflösende Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in Mausstammzell-abgeleiteten Neuronen mit Chromatin-Immunpräzipitation-Exonuklease (ChIP-Exo)
Summary
Eine präzise Bestimmung von Proteinbindungsstellen im genomischen Ist wichtig für das Verständnis der Genregulation. Hier beschreiben wir eine genomische Kartierungsmethode, die chromatinimmunpräzipierte DNA mit Exonukleaseverdauung (ChIP-exo) behandelt, gefolgt von hochdurchsatzhoher Sequenzierung. Diese Methode erkennt Protein-DNA-Wechselwirkungen mit nahezu Base-Pair-Mapping-Auflösung und einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis in Säugetierneuronen.
Abstract
Die Identifizierung spezifischer Protein-DNA-Wechselwirkungen im Genom ist wichtig für das Verständnis der Genregulation. Chromatin-Immunpräzipitation in Verbindung mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq) wird häufig verwendet, um genomweite Bindungsstellen von DNA-bindenden Proteinen zu identifizieren. Die ChIP-seq-Methode wird jedoch durch ihre Heterogenität in der Länge beschallter DNA-Fragmente und unspezifischer Hintergrund-DNA eingeschränkt, was zu einer geringen Kartierungsauflösung und Unsicherheit in DNA-bindenden Stellen führt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, nutzt die Kombination von ChIP mit Exonuklease-Verdauung (ChIP-exo) die 5′ bis 3′ Exonuklease-Verdauung, um die heterogen große immunpräzipierte DNA auf die Protein-DNA-Vernetzungsstelle zu trimmen. Die Exonuklease-Behandlung eliminiert auch unspezifische Hintergrund-DNA. Die bibliotheksvorbereitete und exonukleaseverdsierte DNA kann zur Hochdurchsatzsequenzierung gesendet werden. Die ChIP-exo-Methode ermöglicht eine nahezu Basispaar-Mapping-Auflösung mit größerer Erkennungsempfindlichkeit und reduziertem Hintergrundsignal. Ein optimiertes ChIP-Exo-Protokoll für Säugetierzellen und die Sequenzierung der nächsten Generation wird im Folgenden beschrieben.
Introduction
Die Standorte von Protein-DNA-Wechselwirkungen geben Einblick in die Mechanismen der Genregulation. Chromatin-Immunpräzipitation in Verbindung mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq) wird seit einem Jahrzehnt verwendet, um genomweite Protein-DNA-Wechselwirkungen in lebenden Zellen1,2zu untersuchen. Die ChIP-seq-Methode wird jedoch durch Heterogenität bei der DNA-Fragmentierung und ungebundene DNA-Kontamination eingeschränkt, die zu einer niedrigen Mapping-Auflösung, falschen Positivmeldungen, verpassten Anrufen und einem unspezifischen Hintergrundsignal führen. Die Kombination von ChIP mit Exonuklease-Verdauung (ChIP-exo) verbessert die ChIP-seq-Methode, indem ChIP-DNA auf die Protein-DNA-Vernetzungspunkte gestutzt wird, was eine nahezu Base-Pair-Auflösung und ein niedriges Hintergrundsignal3,4,5bietet. Die stark verbesserte Mapping-Auflösung und der geringe Hintergrund von ChIP-exo ermöglichen die Deko-Lösung präziser und umfassender Protein-DNA-Bindungsstellen im gesamten Genom. ChIP-exo ist in der Lage, funktionell unterschiedliche DNA-bindende Motive, kooperative Wechselwirkungen zwischen Transkriptionsfaktoren (TF) und mehrere Protein-DNA-Vernetzungsstellen an einem bestimmten genomischen Bindungsort zu offenbaren, die durch andere genomische Kartierungsmethodennichtnachweisbar sind 3,4,6,7.
ChIP-exo wurde ursprünglich in angehender Hefe verwendet, um die sequenzspezifische DNA-Bindung von TFs zu untersuchen, um die genaue Organisation des Transkriptions-Vorinitiierungskomplexes und die subnukleosomale Struktur einzelner Histonen im Genom4,8,9zu untersuchen. Seit seiner Einführung im Jahr 20114, ChIP-exo wurde erfolgreich in vielen anderen Organismen einschließlich Bakterien, Mäuse, und menschliche Zellen7,10,11,12,13,14,15,16,17. Im Jahr 2016 verwendeten Rhee et al.14 erstmals ChIP-exo in Säugetierneuronen, um zu verstehen, wie die neuronale Genexpression nach der Downregulation der Programmierung TF Lhx3 aufrechterhalten wurde, die mit einer anderen Programmier-TF Isl1 einen Heterodimer-Komplex bildet. Diese Studie zeigte, dass in Abwesenheit von Lhx3, Isl1 zu neuen neuronalen Enhancer rekrutiert wird, die von Onecut1 TF gebunden sind, um die Genexpression neuronaler Effektorgene aufrechtzuerhalten. In dieser Studie zeigte ChIP-exo, wie mehrere TFs Zelltyp- und zellstufenspezifische DNA-Regulierungselemente in kombinatorischem Weise bei nahezu nukleotid-Mapping-Auflösung dynamisch erkennen. Andere Studien verwendeten auch die ChIP-exo-Methode, um das Zusammenspiel von Proteinen und DNA in anderen Säugetierzelllinien zu verstehen. Han et al.7 verwendeten ChIP-exo, um die genomweite Organisation von GATA1 und TAL1 TFs in Mauserythroidzellen mit ChIP-exo zu untersuchen. Diese Studie ergab, dass TAL1 direkt für die DNA rekrutiert wird und nicht indirekt durch Protein-Protein-Wechselwirkungen mit GATA1 während der Erythroid-Differenzierung. Neuere Studien verwendeten auch ChIP-exo, um die genomweiten Bindungsstellen von CTCF, RNA Polymerase II und Histonmarkierungen zu profilieren, um epigenomische und transkriptionelle Mechanismen in menschlichen Zelllinien18,19zu untersuchen.
Es gibt mehrere Versionen des ChIP-exo Protokolls verfügbar3,5,20. Diese ChIP-exo-Protokolle sind jedoch für Forscher, die mit der Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek der nächsten Generation nicht vertraut sind, schwer zu befolgen. Eine ausgezeichnete Version des ChIP-exo-Protokolls wurde mit leicht verständlichen Anweisungen und einem Video21veröffentlicht, enthielt aber viele enzymatische Schritte, die eine erhebliche Zeitinanspruch samten. Hier berichten wir über eine neue Version des ChIP-exo-Protokolls mit reduzierten enzymatischen Schritten und Inkubationszeiten sowie Erläuterungen für jeden enzymatischen Schritt21. Endreparatur- und dA-Tailing-Reaktionen werden in einem einzigen Schritt mit Endvorbereitungsenzym kombiniert. Die Inkubationszeiten für Index- und Universaladapterligationsschritte werden mit einem Ligationsverstärker von 2 h auf 15 min reduziert. Die Kinase-Reaktion nach dem im vorherigen ChIP-exo-Protokoll beschriebenen Indexadapter-Ligationsschritt wird entfernt. Stattdessen wird während der Oligo-DNA-Synthese eine Phosphatgruppe zu einem der 5′ Enden des Indexadapters (Tabelle 1) hinzugefügt, der für den Lambda-Exonuklease-Verdauungsschritt verwendet wird. Während das vorherige ChIP-exo-Protokoll RecJf Exonuclease-Verdauung verwendet, um einsträngige DNA-Verunreinigungen zu beseitigen, wird dieser Verdauungsschritt hier entfernt, da er für die Qualität der ChIP-exo-Bibliothek nicht entscheidend ist. Zur Reinigung der reverse-vernetzten DNA nach der ChIP-Elution wird anstelle der Extraktionsmethode phenol:chloroform:isoamyl alcohol (PCIA) eine Methode zur Reinigung magnetischer Perlen verwendet. Dies reduziert die Inkubationszeit der DNA-Extraktion. Wichtig ist, dass die Mehrheit der Adapterdimer entfernt wird, die während der Indexadapterligation gebildet werden, was die Effizienz der ligationsvermittelten PCR beeinträchtigen kann.
Das hier vorgestellte ChIP-exo-Protokoll ist für den Nachweis präziser Protein-DNA-Wechselwirkungen in Säugetierneuronen optimiert, die sich von Maus-Embryonalstammzellen (ES) unterscheiden. Kurz werden geerntete und vernetzte neuronale Zellen lysiert, damit Chromatin der Beschallung ausgesetzt und dann beschallt werden kann, so dass dna-Fragmente in angemessener Größe erhalten werden (Abbildung 1). Antikörperbeschichtete Perlen werden dann verwendet, um fragmentiertes, lösliches Chromatin selektiv zu immunprezipitieren, um das Protein von Interesse zu erhalten. Während sich die immunpräzipierte DNA noch auf den Perlen befindet, werden Endreparatur, Ligation von Sequenzierungsadaptern, Einfüllreaktion und 5′ bis 3′ Lambda-Exonuklease-Verdauungsschritte durchgeführt. Der Exonuklease-Verdauungsschritt verleiht ChIP-exo sein ultrahohe Auflösungs- und ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis. Lambda exonuklease schneidet die immunpräzipierte DNA ein paar Base-Pairs (bp) von der Vernetzungsstelle, wodurch kontaminierende DNA abgebaut wird. Die exonukleasebehandelte ChIP-DNA wird aus den antikörperbeschichteten Perlen eluiert, Protein-DNA-Querverbindungen werden umgekehrt und Proteine abgebaut. DNA wird extrahiert und in einsträngige ChIP-DNA denaturiert, gefolgt von Primer-Glühen und Erweiterung, um doppelsträngige DNA (dsDNA) herzustellen. Als nächstes wird die Ligation eines Universaladapters an den exonukleasebehandelten Enden durchgeführt. Die resultierende DNA wird gereinigt, dann PCR verstärkt, gelgereinigt und der Sequenzierung der nächsten Generation unterzogen.
Das ChIP-exo-Protokoll ist länger als das ChIP-seq-Protokoll, aber technisch nicht sehr anspruchsvoll. Jede erfolgreich immunpräzipierte ChIP-DNA kann ChIP-exo mit mehreren zusätzlichen enzymatischen Schritten unterworfen werden. Die bemerkenswerten Vorteile von ChIP-exo, wie ultrahohe Mapping-Auflösung, ein reduziertes Hintergrundsignal und verringerte falsch positive und negative, in Bezug auf genomische Bindungsstellen, überwiegen die Zeitkosten.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll wird ChIP, gefolgt von Exonuklease-Verdauung, verwendet, um DNA-Bibliotheken zur Identifizierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in Säugetierzellen mit ultrahoher Kartierungsauflösung zu erhalten. Viele Variablen tragen zur Qualität des ChIP-exo-Experiments bei. Zu den kritischen experimentellen Parametern gehören die Qualität von Antikörpern, die Optimierung der Beschallung und die Anzahl der LM-PCR-Zyklen. Diese kritischen experimentellen Parameter sind auch, was ChIP-exo-Experimente begrenze…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Mitglied des Rhee-Labors für den Austausch unveröffentlichter Daten und wertvoller Diskussionen. Diese Arbeit wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Stipendium RGPIN-2018-06404 (H.R.) unterstützt.
Materials
| Agarose, UltraPure | Invitrogen | 16500 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| Albumin, Bovine Serum (BSA), Protease Free, Heat Shock Isolation, Min. 98% | BioShop | ALB003 | Blocking Solution |
| Antibody against Isl1 | DSHB | 39.3F7 | Antibody incuation with beads (Section 5.6) |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060010 | Sonicating Chromatin (Section 3.3) |
| Bovine serum albumin (BSA), Molecular Biology Grade | New England BioLabs | B9000S | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | Sonicating Chromatin (Section 3.5), Checking Sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 and 4.3.4) |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 22623508 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3), Cell lysis (Section 2.2 and 2.3), Sonicating Chromatin (Section 3.1) |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Added to all buffers, except Proteinase K buffer and ChIP Elution buffer |
| dATP Solution | New England BioLabs | N0440S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | fisher scientific | BP349 | Lysis Buffer 3, High Salt Wash Buffer and LiCl Wash Buffer |
| dNTP Mix, Molecular Biology Grade | Thermo Scientific | R0192 | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.2) |
| DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x | Thermo Scientific | K1081 | Ligation-Mediated PCR (Section 18.1) |
| EDTA, 0.5 M, Sterile Solution, pH 8.0 | BioShop | EDT111 | Lysis Buffer 1-3, Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer, LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ethyl Alcohol Anhydrous, 100% | Commercial alcohols | P006EAAN | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| Formaldehyde, 36.5-38%, contains 10-15% methanol | Sigma | F8775 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.1) |
| Glycerol, Reagent Grade, min 99.5% | BioShop | GLY002 | Lysis Buffer 1 |
| Glycine, Biotechnology Grade, min. 99% | BioShop | GLN001 | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.2) |
| Glycogen, RNA Grade | Thermo Scientific | R0551 | Checking Sonication (Section 4.3.3) |
| HEPES, 1 M Sterile-filtered Solution, pH 7.3 | BioShop | HEP003 | Lysis Buffer 1, High Salt Wash Buffer |
| Klenow Fragment (3->5 exo-) | New England BioLabs | M0212S | dA-Tailing Reaction (Section 15.1) |
| Lambda exonuclease | New England BioLabs | M0262S | Lambda Exonuclease Digestion on Beads (Section 11.2) |
| Ligase Enhancer | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Ligase Master Mix | New England BioLabs | E7645S | NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Index Adapter Ligation on Beads (Section 9.1) and Universal Adapter Ligation (Section 16.1) |
| Lithium Chloride (LiCl), Reagent grade | Bioshop | LIT704 | LiCl Wash Buffer |
| Magnetic beads for ChIP (Dynabeads Protein G) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP) | Antibody incubation with beads (Section 5) |
| Magnetic beads for DNA purification (AMPure XP Beads) | Beckman Coulter | A63880 | DNA Extraction (Section 13.3) and DNA Clean-up (Section 17.1) |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Invitrogen | 12321D | Used in many steps in Sections: 5 – 11, 13 |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.2) |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 30% aqueous solution, ≥97.0% (HPLC) | Sigma | 61747 | Lysis Buffer 3 |
| Octylphenol Ethoxylate (IGEPAL CA630) | BioShop | NON999 | Lysis Buffer 1 and LiCl Wash Buffer |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol, Biotechnology Grade (25:24:1) | BioShop | PHE512 | Checking Sonication (Section 4.3.1) |
| phi29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269L | Fill-in Reaction on Beads (Section 10.2) and Denaturing, Primer Annealing and Primer Extension (Section 14.3 and 14.4) |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning | 21040CV | Harvest, cross-linking and freezing cells (Section 1.3) and Sonicating Chromatin (Section 3.1), Antibody incuation with beads (Section 5.1) |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Checking Sonication (Section 4.3.6) and Gel Purification of LM-PCR Amplified DNA (Section 19.1) |
| ProFlex PCR System | Applied Biosystems | ProFlex PCR System | Used in Sections: 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 and 18.2 |
| Protein LoBind Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3) |
| Proteinase K Solution, RNA Grade | Invitrogen | 25530049 | Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3) |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Quibit dsDNA BR assay kit | Invitrogen | Q32853 | Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3) |
| Rnase A, Dnase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | Checking Sonication (Section 4.3.2) and DNA Extraction (Section 13.2) |
| Sodium chloride (NaCl), BioReagent | Sigma | S5886 | Lysis Buffer 1-3, High Salt Wash Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Electrophoresis Grade | BioShop | SDS001 | Checking Sonication (Section 4.1), High Salt Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Sonication beads and 15 mL Bioruptor Tubes | Diagenode | C01020031 | Sonicating Chromatin (Section 3.1 and 3.2) |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 and 16.2 |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 7.4 | Sigma | T2194 | 10 mM Tris-HCl Buffer |
| Trizma hydrochloride solution (Tris-HCl), BioPerformance Certified, 1 M, pH 8.0 | Sigma | T2694 | Lysis Buffer 2, Lysis Buffer 3, Checking Sonication (Section 4.1), LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer |
| Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn) | New England BioLabs | E7546S | End Prep Reaction mix and End Prep Enzyme mix. End-repair and dA-Tailing Reaction on Beads (Section 8.2) |
| VWR Mini Tube Rocker, Variable Speed | VWR | 10159-752 | Used in many steps in sections: 1, 2, 5, 6 and 7 |
| 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol, Triton X-100, Reagent Grade | BioShop | TRX506 | Lysis Buffer 1, Sonicating Chromatin (Section 3.4) and High Salt Wash Buffer |
References
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