Cartographie à haute résolution des interactions protéine-ADN dans les neurones dérivés des cellules souches de souris à l’aide de l’immunoprécipitation-exonucléase chromatine (ChIP-Exo)

Les emplacements des interactions protéine-ADN donnent un aperçu des mécanismes de régulation des gènes. L’immunoprécipitation de la chromatine couplée au séquençage à haut débit (ChIP-seq) est utilisée depuis une décennie pour examiner les interactions protéine-ADN à l’échelle du génome dans les cellules^{vivantes 1,2}. Cependant, la méthode ChIP-seq est limitée par l’hétérogénéité dans la fragmentation de l’ADN et la contamination non lié de l’ADN qui conduisent à une faible résolution cartographique, de faux positifs, des appels manqués et un signal d’arrière-plan non spécifique. La combinaison du ChIP avec la digestion d’exonuclease (ChIP-exo) améliore la méthode de ChIP-seq en coupant l’ADN de ChIP aux points de croisement de protéine-ADN, fournissant la résolution proche de base-paire et un signal bas de fond^3,4,5. La résolution cartographique grandement améliorée et le faible fond fourni par ChIP-exo permettent de déterminer des emplacements précis et complets de liaison protéine-ADN dans l’ensemble du génome. ChIP-exo est capable de révéler des motifs fonctionnellement distincts liant l’ADN, des interactions coopératives entre les facteurs de transcription (TF), et de multiples sites de liaison protéine-ADN dans un certain endroit de liaison génomique, non détectable par d’autres méthodes de cartographie^{génomique 3,4,6,7}.

ChIP-exo a d’abord été utilisé dans la levure naissante pour examiner la liaison spécifique à l’ADN des TF, pour étudier l’organisation précise du complexe de transcription pré-initiation, et la structure sous-nucléosomale des histones individuelles à travers^{le génome 4,8,9}. Depuis son introduction en 2011⁴, ChIP-exo a été utilisé avec succès dans de nombreux autres organismes, y compris les bactéries, les souris et^{les cellules humaines 7,10,11,12,13,14,15,16,17}. En 2016, Rhee et coll.^{14 ont} utilisé chIP-exo dans les neurones mammifères pour la première fois pour comprendre comment l’expression neuronale des gènes a été maintenue après la downregulation de la programmation TF Lhx3, qui forme un complexe d’heterodimer avec une autre programmation TF Isl1. Cette étude a montré qu’en l’absence de Lhx3, Isl1 est recruté à de nouveaux exhausteurs neuronaux liés par Onecut1 TF pour maintenir l’expression génétique des gènes effecteurs neuronaux. Dans cette étude, ChIP-exo a révélé comment plusieurs TF reconnaissent dynamiquement le type cellulaire et les éléments de régulation de l’ADN spécifiques au stade cellulaire d’une manière combinatoire à la résolution de cartographie quasi nucléotide. D’autres études ont également utilisé la méthode ChIP-exo pour comprendre l’interaction entre les protéines et l’ADN dans d’autres lignées cellulaires de mammifères. Han et coll.^{7 ont utilisé} ChIP-exo pour examiner l’organisation à l’échelle du génome des TF GATA1 et TAL1 dans les cellules érythroïdes de souris à l’aide de ChIP-exo. Cette étude a révélé que TAL1 est directement recruté à l’ADN plutôt qu’indirectement par des interactions protéine-protéine avec GATA1 tout au long de la différenciation érythroïde. Des études récentes ont également utilisé ChIP-exo pour profiler les emplacements de liaison à l’échelle du génome de CTCF, RNA Polymerase II, et les marques d’histone pour étudier les mécanismes épigénomiques et transcriptionnels dans les lignées^{cellulaires humaines 18,19}.

Il existe plusieurs versions du protocole ChIP-exo disponibles^3,5,20. Cependant, ces protocoles ChIP-exo sont difficiles à suivre pour les recherches qui ne sont pas familiers avec la préparation de la bibliothèque de séquençage de prochaine génération. Une excellente version du protocole ChIP-exo a été publiée avec des instructions faciles à suivre et une vidéo²¹, mais contenait de nombreuses étapes enzymatiques qui nécessitent beaucoup de temps pour terminer. Ici, nous rapportons une nouvelle version du protocole ChIP-exo contenant des étapes enzymatiques réduites et les temps d’incubation, et des explications pour chaque étape enzymatique²¹. Les réactions de réparation d’extrémité et de dA-tailing sont combinées en une seule étape utilisant l’enzyme de préparation d’extrémité. Les temps d’incubation des étapes de ligature de l’index et de l’adaptateur universel sont réduits de 2 h à 15 min à l’aide d’un exhausteur de ligature. La réaction de kinase après l’étape de ligature d’adaptateur d’index décrite dans le protocole précédent de ChIP-exo est enlevée. Au lieu de cela, un groupe de phosphate est ajouté lors de la synthèse de l’ADN oligo à l’une des extrémités de 5′ de l’adaptateur de l’index (tableau 1), qui sera utilisé pour l’étape de digestion de l’exonucléase lambda. Alors que le protocole chip-exo précédent utilisait la digestion de l’exonucléase RecJ_f pour éliminer les contaminants de l’ADN échoués, cette étape de digestion est enlevée ici parce qu’elle n’est pas critique pour la qualité de la bibliothèque ChIP-exo. En outre, pour purifier l’ADN inversé-croisé après elution de ChIP, une méthode magnétique de purification de perles est employée au lieu du phénol : chloroforme : méthode d’extraction d’alcool d’isoamyl (PCIA). Cela réduit le temps d’incubation de l’extraction de l’ADN. Fait important, il supprime la majorité des dimers adaptateurs formés lors de la ligature de l’adaptateur d’index, ce qui peut avoir un impact sur l’efficacité de la ligature médiée PCR.

Le protocole ChIP-exo présenté ici est optimisé pour la détection d’interactions protéines-ADN précises chez les neurones mammifères différenciés des cellules souches embryonnaires de souris (ES). En bref, les cellules neuronales récoltées et reliées entre elles sont lysées, afin de permettre à la chromatine d’être exposée à la sonication, puis sonnée de sorte que des fragments d’ADN de taille appropriée soient obtenus (figure 1). Les perles enduites d’anticorps sont ensuite utilisées pour immunoprécipifier sélectivement la chromatine fragmentée et soluble à la protéine d’intérêt. Tandis que l’ADN immunoprécipité est toujours sur les perles, la réparation finale, la ligature des adaptateurs de séquençage, la réaction de remplissage et les étapes de digestion d’exonuclease de lambda de 5′ à 3′ sont exécutées. L’étape de digestion de l’exonucléase est ce qui donne à ChIP-exo sa très haute résolution et son rapport signal-bruit élevé. Lambda exonuclease coupe l’ADN immunoprécipité quelques paires de base (bp) du site de liaison croisée, causant ainsi la contamination de l’ADN à dégrader. L’ADN chip traité à l’exonucléase est éludé des perles enduites d’anticorps, les liens croisés protéine-ADN sont inversés et les protéines sont dégradées. L’ADN est extrait et dénaturé à l’ADN de ChIP simple brin, suivi de l’annealing d’amorce et de l’extension pour faire l’ADN double-échoué (DsDNA). Ensuite, la ligature d’un adaptateur universel aux extrémités traitées par l’exonucléase est effectuée. L’ADN qui en résulte est purifié, puis amplifié par PCR, purifié en gel et soumis au séquençage de la prochaine génération.

Le protocole ChIP-exo est plus long que le protocole ChIP-seq, mais n’est pas très techniquement difficile. N’importe quel ADN immunoprécipité avec succès de ChIP peut être soumis au ChIP-exo, avec plusieurs étapes enzymatiques additionnables. Les avantages notables du ChIP-exo, tels que la résolution de cartographie ultra-élevée, un signal de fond réduit, et la diminution des faux positifs et négatifs, en ce qui concerne les sites de liaison génomique, l’emportent sur le coût du temps.