Mapeo de alta resolución de interacciones proteína-ADN en neuronas derivadas de células madre del ratón utilizando inmunoprecipitación de cromatina-exonucleasa (ChIP-Exo)

Las ubicaciones de las interacciones proteína-ADN proporcionan información sobre los mecanismos de regulación genética. La inmunoprecipitación de cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) se ha utilizado durante una década para examinar las interacciones proteína-ADN en todo el genoma en las células vivas^1,2. Sin embargo, el método ChIP-seq está limitado por la heterogeneidad en la fragmentación del ADN y la contaminación de ADN no entrante que conducen a una baja resolución cartográfica, falsos positivos, llamadas perdidas y señal de fondo no específica. La combinación de ChIP con digestión exonucleasa (ChIP-exo) mejora el método ChIP-seq recortando el ADN ChIP a los puntos de enlace proteína-ADN, proporcionando una resolución cercana al par base y una señal de fondo baja^3,4,5. La resolución cartográfica muy mejorada y los bajos antecedentes proporcionados por ChIP-exo permiten determinar ubicaciones precisas y completas de unión proteína-ADN en todo el genoma. ChIP-exo es capaz de revelar motivos funcionalmente distintos de unión al ADN, interacciones cooperativas entre factores de transcripción (TF) y múltiples sitios de enlace proteína-ADN en una determinada ubicación de unión genómica, no detectable por otros métodos de cartografía genómica^3,4,6,7.

ChIP-exo se utilizó inicialmente en levadura en ciernes para examinar la unión de ADN específica de secuencia de los TFs, para estudiar la organización precisa del complejo de transcripción previa a la iniciación, y la estructura sub-nucleosomal de histonas individuales a través del genoma^4,8,9. Desde su introducción en 2011^4,ChIP-exo se ha utilizado con éxito en muchos otros organismos incluyendo bacterias, ratones y células humanas^{7,10,11,12,13,14,15,16,17.} En 2016, Rhee et al.¹⁴ utilizaron ChIP-exo en neuronas de mamíferos por primera vez para entender cómo se mantuvo la expresión génica neuronal después de la regulación descendente de la programación tf Lhx3, que forma un complejo heterodímero con otra programación TF Isl1. Este estudio demostró que en ausencia de Lhx3, Isl1 es reclutado para nuevos potenciadores neuronales unidos por Onecut1 TF para mantener la expresión génica de genes efectores neuronales. En este estudio, ChIP-exo reveló cómo múltiples TFs reconocen dinámicamente el tipo de célula y los elementos reguladores de ADN específicos de la etapa celular de una manera combinatoria a la resolución de mapeo de casi nucleótidos. Otros estudios también utilizaron el método ChIP-exo para entender la interacción entre las proteínas y el ADN en otras líneas celulares de mamíferos. Han et al.⁷ utilizó ChIP-exo para examinar la organización del genoma de los TFs GATA1 y TAL1 en células eritródicas de ratón utilizando ChIP-exo. Este estudio encontró que TAL1 se recluta directamente para el ADN en lugar de indirectamente a través de interacciones proteína-proteínas con GATA1 a lo largo de la diferenciación eritroide. Estudios recientes también utilizaron ChIP-exo para perfilar las ubicaciones de unión a todo el genoma de CTCF, ARN Polymerase II y marcas de histona para estudiar mecanismos epigenómicos y transcripcionales en líneas celulares humanas^18,19.

Hay varias versiones del protocolo ChIP-exo disponibles^3,5,20. Sin embargo, estos protocolos ChIP-exo son difíciles de seguir para las investigaciones que no están familiarizadas con la preparación de la biblioteca de secuenciación de próxima generación. Una excelente versión del protocolo ChIP-exo fue publicada con instrucciones fáciles de seguir y un video^21,pero contenía muchos pasos enzimáticos que requieren una cantidad significativa de tiempo para completarse. Aquí informamos de una nueva versión del protocolo ChIP-exo que contiene pasos enzimáticos reducidos y tiempos de incubación, y explicaciones para cada paso enzimático²¹. Las reacciones de reparación final y relaves dA se combinan en un solo paso utilizando la enzima de preparación final. Los tiempos de incubación de los pasos de ligadura del adaptador universal y de índice se reducen de 2 h a 15 min utilizando un potenciador de ligadura. Se elimina la reacción quinasa después del paso de ligadura del adaptador de índice descrito en el protocolo ChIP-exo anterior. En su lugar, se agrega un grupo de fosfato durante la síntesis de ADN de oligo a uno de los extremos de 5′ del adaptador de índice(Tabla 1),que se utilizará para el paso de digestión lambda exonuclease. Mientras que el protocolo chip-exo anterior utilizó la digestión RecJ_f exonuclease para eliminar contaminantes de ADN de una sola cadena, este paso de digestión se elimina aquí porque no es crítico para la calidad de la biblioteca ChIP-exo. Además, para purificar el ADN de enlace inverso después de la elución chip, se utiliza un método de purificación de cuentas magnéticas en lugar del método de extracción de fenol:cloroformo:alcohol isoamilo (PCIA). Esto reduce el tiempo de incubación de la extracción de ADN. Es importante destacar que elimina la mayoría de los atenuadores de adaptador formados durante la ligadura del adaptador de índice, lo que puede afectar a la eficiencia de la PCR mediada por ligadura.

El protocolo ChIP-exo presentado aquí está optimizado para la detección de interacciones precisas proteína-ADN en neuronas de mamíferos diferenciadas de las células madre embrionarias (ES) del ratón. Brevemente, las células neuronales cosechadas y reticuladas se miman, para permitir que la cromatina esté expuesta a la sonicación, luego sonicadas para que se obtengan fragmentos de ADN de tamaño adecuado(Figura 1). Las cuentas recubiertas de anticuerpos se utilizan para inmunoprecipitar selectivamente la cromatina fragmentada y soluble a la proteína de interés. Mientras que el ADN inmunoprecipitado todavía está en las cuentas, se realizan pasos de reparación final, ligadura de adaptadores de secuenciación, reacción de relleno y 5′ a 3′ pasos de digestión exonucleasa lambda. El paso de digestión exonuclease es lo que le da a ChIP-exo su alta resolución y alta relación señal-ruido. Lambda exonuclease recorta el ADN inmunoprecipitado a unos pocos pares de bases (bp) del sitio de enlace cruzado, lo que hace que el ADN contaminante se degrade. El ADN ChIP tratado con exonucleasa se eluta de las cuentas recubiertas de anticuerpos, se invierten los enlaces cruzados proteína-ADN y se degradan las proteínas. El ADN se extrae y desnaturaliza al ADN ChIP de una sola cadena, seguido de recocido de imprimación y extensión para hacer ADN de doble cadena (dsDNA). A continuación, se realiza la ligadura de un adaptador universal a los extremos tratados con exonucleasa. El ADN resultante se purifica, luego pcr amplificado, gel purificado, y sometido a secuenciación de próxima generación.

El protocolo ChIP-exo es más largo que el protocolo ChIP-seq, pero no es muy difícil técnicamente. Cualquier ADN ChIP inmunoprecipitado con éxito puede ser sometido a ChIP-exo, con varios pasos enzimáticos adicionales. Las ventajas notables de ChIP-exo, como la resolución de mapeo ultra alta, una señal de fondo reducida y la disminución de falsos positivos y negativos, con respecto a los sitios de enlace genómico, superan el costo de tiempo.