Mapeamento de alta resolução de interações proteína-DNA em neurônios derivados de células-tronco do rato usando Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Os locais das interações proteína-DNA fornecem uma visão dos mecanismos de regulação genética. A imunoprecipitação de cromatina juntamente com o sequenciamento de alto rendimento (ChIP-seq) tem sido usada há uma década para examinar interações genoma-DNA em células vivas^1,2. No entanto, o método ChIP-seq é limitado pela heterogeneidade na fragmentação do DNA e contaminação de DNA desvinculada que leva a baixa resolução de mapeamento, falsos positivos, chamadas perdidas e sinal de fundo não específico. A combinação de ChIP com digestão exonuclease (ChIP-exo) melhora o método ChIP-seq, aparando o DNA ChIP aos pontos de cruzamento de DNA proteico, fornecendo resolução próxima do par de base e um sinal de fundo baixo^3,4,5. A resolução de mapeamento muito melhorada e o baixo fundo fornecido pelo ChIP-exo permitem que locais precisos e abrangentes de ligação proteína-DNA sejam determinados em todo o genoma. O ChIP-exo é capaz de revelar motivos de ligação de DNA funcionalmente distintos, interações cooperativas entre fatores de transcrição (TF) e múltiplos locais de ligação entre proteínas e DNA em um determinado local de ligação genômica, não detectável por outros métodos de mapeamento genômico^3,4,6,7.

ChIP-exo foi inicialmente usado em levedura brotante para examinar a vinculação de DNA específica de sequência de TFs, para estudar a organização precisa do complexo de pré-iniciação da transcrição, e estrutura subnucleosômica de histones individuais através do genoma^4,8,9. Desde sua introdução em 2011⁴, o ChIP-exo tem sido utilizado com sucesso em muitos outros organismos, incluindo bactérias, camundongos e células humanas^{7,10,11,12,13,14,15,16,17}. Em 2016, Rhee et al.¹⁴ usaram ChIP-exo em neurônios mamíferos pela primeira vez para entender como a expressão genética neuronal foi mantida após a baixa regulação da programação TF Lhx3, que forma um complexo heterodimer com outra programação TF Isl1. Este estudo mostrou que, na ausência de Lhx3, o Isl1 é recrutado para novos intensificadores neuronais ligados pelo Onecut1 TF para manter a expressão genética dos genes efeitos neuronais. Neste estudo, o ChIP-exo revelou como vários TFs reconhecem dinamicamente o tipo celular e elementos regulatórios de DNA específicos do estágio celular de forma combinatória na resolução de mapeamento de quase nucleotídeos. Outros estudos também usaram o método ChIP-exo para entender a interação entre proteínas e DNA em outras linhas celulares de mamíferos. Han et al.⁷ usaram ChIP-exo para examinar a organização genoma de GATA1 e TAL1 TFs em células eritróides de camundongos usando ChIP-exo. Este estudo descobriu que o TAL1 é diretamente recrutado para o DNA e não indiretamente através de interações proteína-proteína com GATA1 ao longo da diferenciação eritrócrio. Estudos recentes também usaram ChIP-exo para traçar o perfil dos locais de ligação em todo o genoma de CTCF, RNA Polymerase II e histonas para estudar mecanismos epigenômicos e transcricionais nas linhas celulares humanas^18,19.

Existem várias versões do protocolo ChIP-exo disponíveis^3,5,20. No entanto, esses protocolos ChIP-exo são difíceis de seguir para pesquisas que não estão familiarizados com a preparação da biblioteca de sequenciamento de próxima geração. Uma excelente versão do protocolo ChIP-exo foi publicada com instruções fáceis de seguir e um vídeo^21,mas continha muitas etapas enzimáticas que requerem uma quantidade significativa de tempo para ser concluída. Aqui relatamos uma nova versão do protocolo ChIP-exo contendo etapas enzimáticas reduzidas e tempos de incubação, e explicações para cada etapa enzimática²¹. O reparo final e as reações de cauda dA são combinadas em um único passo usando enzima de preparação final. Os tempos de incubação para etapas de ligadura de índice e adaptador universal são reduzidos de 2h para 15 min usando um melhorador de ligadura. A reação de quinase após a etapa de ligadura do adaptador de índice descrita no protocolo ChIP-exo anterior é removida. Em vez disso, um grupo de fosfato é adicionado durante a síntese de DNA oligo a uma das extremidades de 5′ do adaptador de índice(Tabela 1), que será usado para a etapa de digestão de exonuclease lambda. Enquanto o protocolo chip-exo anterior usou recJ_f digestão exonuclease para eliminar contaminantes de DNA de uma única cadeia, este passo de digestão é removido aqui porque não é crítico para a qualidade da biblioteca ChIP-exo. Além disso, para purificar o DNA cruzado reverso após a elução do ChIP, um método de purificação de contas magnéticas é usado em vez do método de extração fenol:clorofórmio:isoamyl álcool (PCIA). Isso reduz o tempo de incubação da extração de DNA. É importante ressaltar que ele remove a maioria dos dimers adaptadores formados durante a ligante do adaptador de índice, o que pode afetar a eficiência do PCR mediado por ligadura.

O protocolo ChIP-exo apresentado aqui é otimizado para a detecção de interações proteicas precisas e DNA em neurônios mamíferos diferenciados das células-tronco embrionárias do camundongo (ES). Brevemente, as células neuronais colhidas e cruzadas são lísedas, para permitir que a cromatina seja exposta à sônica, e depois sônica para que fragmentos de DNA de tamanho adequado sejam obtidos(Figura 1). As contas revestidas de anticorpos são então usadas para imunoprecipitar seletivamente cromatina fragmentada e solúvel à proteína de interesse. Enquanto o DNA imunoprecipitado ainda está nas contas, reparação final, ligadura de adaptadores de sequenciamento, reação de preenchimento e passos de digestão exonuclease lambda de 5′ a 3′ são realizados. O passo de digestão exonuclease é o que dá ao ChIP-exo sua ultra-alta resolução e alta relação sinal-ruído. Lambda exonuclease apara o DNA imunoprecipitado alguns pares de base (bp) do local de crosslinking, fazendo com que o DNA contaminante seja degradado. O DNA ChIP tratado pela exonuclease é eludido das contas revestidas de anticorpos, os crosslinks de DNA proteico são invertidos e as proteínas são degradadas. O DNA é extraído e desnaturado ao DNA ChIP de um único fio, seguido de ressarem e extensão para fazer DNA de dupla derivação (dsDNA). Em seguida, é realizada a ligadura de um adaptador universal para as extremidades tratadas com exonuclease. O DNA resultante é purificado, então PCR amplificado, gel purificado e submetido ao sequenciamento de próxima geração.

O protocolo ChIP-exo é mais longo que o protocolo ChIP-seq, mas não é muito desafiador tecnicamente. Qualquer DNA ChIP imunoprecipitado com sucesso pode ser submetido a ChIP-exo, com várias etapas enzimáticas adicionais. As notáveis vantagens do ChIP-exo, como resolução de mapeamento ultra-alta, um sinal de fundo reduzido e diminuição de falsos positivos e negativos, em relação a sites de vinculação genômica, superam o custo de tempo.