Ottimizzazione per il sequenziamento e l'analisi di campioni FFPE-RNA degradati

L’uso di approcci di sequenziamento di nuova generazione ci ha permesso di ottenere una grande quantità di informazioni da vari tipi di campioni. Tuttavia, i campioni vecchi e mal conservati rimangono inutilizzabili per i metodi comunemente utilizzati per generare dati di sequenza e spesso richiedono modifiche a protocolli consolidati. I tessuti FFPE rappresentano un tale tipo di campione che è stato ampiamente utilizzato per i campioni clinici^1,2,3. Mentre la conservazione FFPE mantiene la morfologia dei tessuti, gli acidi nucleici nei tessuti FFPE di solito presentano una vasta gamma di danni e degradazione, rendendo difficile recuperare le informazioni genomiche che possono portare a importanti intuizioni sui meccanismi molecolari alla base di vari disturbi.

I dati sull’espressione genica generati dal sequenziamento dell’RNA sono spesso fondamentali per studiare i meccanismi di malattia e resistenza e integrano l’analisi della mutazione del DNA. Tuttavia, l’RNA è più suscettibile alla degradazione, il che rende più difficile generare dati accurati sull’espressione genica dai tessuti FFPE. Inoltre, poiché l’ampia disponibilità e convenienza del sequenziamento è relativamente recente, gli esemplari più vecchi spesso non sono stati immagazzinati nelle condizioni necessarie per preservare l’integrità dell’RNA. Alcuni dei problemi per i campioni di FFPE includono la degradazione dell’RNA a causa dell’incorporamento in paraffina, la modifica chimica dell’RNA che porta alla frammentazione o alla refrattanza ai processi enzimatici necessari per il sequenziamento e la perdita delle code poli-A, limitando l’applicabilità dell’oligo-dT come primer per la tranciatura inversa⁴. Un’altra sfida è la manipolazione/archiviazione di campioni di FFPE in condizioni non ottimali, che può portare a un’ulteriore degradazione delle molecole labili come l’RNA nei tessuti⁵. Ciò è particolarmente rilevante per i campioni più vecchi che potrebbero essere stati raccolti in un momento in cui l’analisi dell’espressione genica mediante il sequenziamento dell’RNA non era prevista per i campioni. Tutto ciò porta a una diminuzione della qualità e della quantità dell’RNA estratto disponibili per la generazione di dati di sequenza utili. La bassa probabilità di successo, combinata con l’alto costo del sequenziamento, ha dissuaso molti ricercatori dal cercare di generare e analizzare i dati dell’espressione genica da campioni FFPE potenzialmente utili. Alcuni studi negli ultimi anni hanno dimostrato l’usabilità dei tessuti FFPE per l’analisi dell’espressione genica^2,6,7,8,9, anche se per meno campioni e/o più recenti.

Come studio di fattibilità, abbiamo utilizzato l’RNA estratto da campioni di tessuto tumorale FFPE da tre repository di tessuti residui da registri di sorveglianza, epidemiologia e risultati finali (SEER) per il sequenziamento dell’RNA e l’analisi dell’espressione genica¹⁰. Procurati da laboratori di patologia clinica, i tessuti FFPE da adenocarcinomi sigillanti ovarici di alta qualità sono stati conservati da 7 a 32 anni in condizioni variabili prima dell’estrazione dell’RNA. Poiché nella maggior parte dei casi questi blocchi erano stati immagazzinati in siti diversi per anni senza l’aspettativa di alcuna analisi genetica sensibile in futuro, non era stata prestata molta attenzione per preservare gli acidi nucleici. Così, la maggior parte dei campioni esibivano RNA di scarsa qualità, con una grande percentuale di campioni contaminati da batteri. Tuttavia, siamo stati in grado di eseguire la quantificazione genica, misurare l’uniformità e la continuità della copertura genica ed eseguire l’analisi della correlazione di Pearson tra repliche biologiche per misurare la riproducibilità. Sulla base di una serie di pannelli genetici chiave, abbiamo confrontato i campioni nel nostro studio con i dati di The Cancer Genome Atlas (TCGA) e abbiamo confermato che circa il 60% dei campioni aveva profili di espressione genica comparabili¹¹. In base alla correlazione tra vari risultati QC e metadati di esempio, abbiamo identificato le metriche chiave di Controllo qualità che hanno un buon valore predittivo per identificare i campioni che hanno maggiori probabilità di generare dati di sequenza utilizzabili¹¹.

Qui descriviamo la metodologia utilizzata per la valutazione della qualità FFPE-RNA, la generazione di librerie di sequenziamento a partire da campioni di RNA estratti e l’analisi bioinformatica dei dati di sequenziamento.